ABCトランスポーターMsbAの脂質および銅制御の構造基盤

Nature Communications volume 13、記事番号: 7291 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

リポ多糖 (LPS) 生合成における重要なステップには、LPS 前駆体であるリポオリゴ糖を内膜の細胞質から周質小葉に反転することが含まれます。この操作は、ATP 結合カセットトランスポーター MsbA によって実行されます。 MsbA の内腔への LPS の結合は十分に確立されていますが、他の部位での MsbA と脂質の相互作用の選択性はまだ十分に理解されていません。 ここでは、ネイティブ質量分析 (MS) を使用して、MsbA と脂質の相互作用を特徴付け、構造研究を導きます。 我々は、トランスポーターが銅(II)と共精製し、金属結合がタンパク質-脂質相互作用を調節することを示した。 銅(II)と複合体を形成したMsbAのN末端領域の分解能2.15Åの構造が提示され、高親和性銅(II)キレーターであるGHKペプチドを彷彿とさせる構造が明らかになりました。 我々の結果は、特に LPS 前駆体である 3-デオキシ-D-マンノ-オクト-2-ウロソン酸 (Kdo)2-リピド A (KDL) に対する立体構造依存性の脂質結合親和性を示しています。 我々は、アデノシン5'-二リン酸とバナジン酸塩を含む開いた外向き立体構造にトラップされたMsbAの3.6Å分解能の構造を報告し、脂質がトランスポーターと広範な相互作用を形成する明確なKDL結合部位を明らかにした。 さらなる研究により、外部KDL結合部位が保存されており、ATPアーゼ活性のポジティブアロステリックモジュレーターであり、トランスポーター活性とLPS生合成を結び付けるフィードフォワード活性化機構として機能するという証拠が得られている。

ほとんどのグラム陰性菌の決定的な特徴は、外膜の外側小葉にリポ多糖 (LPS) が存在することです 1,2,3。 LPS は、細菌が抗生物質や環境ストレスに抵抗できるようにする不浸透性バリアの形成に貢献します2。 LPS の生合成は、LPS 前駆体リポオリゴ糖 (LOS) の生成により細胞質内で始まり、その後、さらなる修飾を伴う細胞表面への組織的な輸送が続きます (図 1a)4。 LOS には、4 ～ 7 本のアシル鎖を持つグルコサミンの二リン酸化二糖 (GlcN) である保存されたリピド A 部分が含まれており、3-デオキシ-D-マンノ-オクト-2-ウロソン酸 (Kdo) 糖で修飾されています1。 さらなる装飾には、細菌ごとに異なるコアオリゴ糖の結合が含まれます2。 細胞質 LOS は、内膜の内側から周辺質小葉へ反転されます。これは、ATP 結合カセット (ABC) トランスポーター MsbA によって実行される重要なステップです。 MsbA の阻害または欠失は致死的であるため 5、このトランスポーターは抗生物質開発の魅力的な標的として浮上しています。 最近、トランスポーターを内向き（IF）構造で捕捉したり、基質結合を模倣したりするなど、作用機序が異なる小分子 MsbA 阻害剤が開発されました 6、7、8、9、10。

a リポ多糖の生合成が細胞質で始まり、リポオリゴ糖 (LOS) が生成されます。 LOS は、保存されたリピド A 構造（灰色）、3-デオキシ-D-マンノ-オクト-2-ウロソン酸（Kdo）糖（オレンジ）およびコアオリゴ糖（紫）で修飾されたグルコサミンのビスリン酸化二糖で構成されています。細菌に依存しています。 MsbA は、ATP の加水分解を動力源として、細胞質 LOS を内膜の内側から外側に反転させます。これは、LPS 生合成の重要なステップです。 反転された LOS は、追加の修飾とともに外膜に輸送され、LPS になります。 b C10E5 の最適化された MsbA サンプルのネイティブ質量スペクトルは、十分に分解された質量スペクトルを生成します。 c 部分的に負荷されたMsbAに対する個々の脂質結合イベントの平衡解離定数（KD）。 d パネル b に示す質量スペクトルのデコンボリューション。 異なる分子種は二量体 MsbA と異なる数の結合銅イオンに対応します。 e 銅(II)を負荷した後のMsbAの測定質量は、2つの結合部位が飽和していることを示しています。 f 銅(II)が完全にロードされたMsbAへの個々の脂質結合イベントのKD。 平均値と標準偏差が報告されます (n = 3、生物学的反復)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

生物物理学的手法の武器を使用した多くの研究により、MsbA6、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 の機構的および構造的な洞察が提供されています。 MsbA はホモ二量体を形成し、各サブユニットは膜貫通ドメイン (TMD、サブユニットあたり 6 つの膜貫通ヘリックス) とサイトゾルに露出したヌクレオチド結合ドメイン (NBD) から構成されます 21。 MsbA が二重層を越えて LOS を移動させる提案されたメカニズムには、いくつかのステップが含まれます 6,17。 Apo またはアデノシン 5'-二リン酸 (ADP) に結合した MsbA は、空間的に分離された NBD を含む IF 立体構造を形成し、嵩高い LOS の侵入と結合を促進します。 中心部、内部腔、およびアデノシン 5'-三リン酸 (ATP) の MsbA への LOS の結合は、NBD の二量体化を促進します。 ATP の加水分解は、外向き (OF) 構造への構造変化を引き起こし、LOS を内膜のペリプラズム側に輸送します。 LOS と無機リン酸が放出され、MsbA は IF 構造に戻ります。 他の多くの ABC トランスポーターと同様に、MsbA の ATPase 活性は、さまざまな基質、特に 3-デオキシ-D-マンノ-オクト-2-ウロソン酸 (Kdo)2-リピド A などのヘキサアシル化リピド A 種の存在下で刺激されます ( KDL）22、23、24。 MsbA による内腔内の LPS の高度に選択的な認識はよく理解されています 6,17 が、他の部位に結合する脂質に対する MsbA ATPase 活性の刺激の構造的基盤は依然としてよく理解されていません。

ネイティブ質量分析 (MS) は、膜タンパク質複合体およびその脂質や他の分子との相互作用を研究するために不可欠な生物物理学的手法として浮上しています 25。 この技術は、気相中の膜タンパク質の非共有結合性相互作用とネイティブのような構造を保存する能力を備えている 26,27 ため、ヌクレオチド、薬物、ペプチド、脂質結合を含むさまざまな生化学的相互作用に関する洞察力に富んだ情報を提供し、熱力学データも得ています。タンパク質間、タンパク質間、タンパク質間、およびタンパク質間相互作用28、29、30、31、32、33、34、35。 この研究では、さまざまな立体構造状態における MsbA と脂質の相互作用を特徴付けることに着手しました。 そしてバナジン酸塩でトラップされ、外側を向いています。 ネイティブ MS 研究では、MsbA が銅(II) と共精製されるだけでなく、MsbA と脂質の相互作用が金属結合やタンパク質の立体構造によって直接影響されることが明らかになりました。 構造研究により、他のABC構造ではこれまで観察されていなかったKDL結合部位が明らかになりました。 私たちの発見は、MsbA の金属と脂質の制御について新たな洞察をもたらします。

MsbA は LPS および他の脂質と同時精製することが報告されている 17,36 ため、我々の最初の目的は、ネイティブ MS 研究用に大腸菌からの MsbA の精製を最適化することでした。 界面活性剤 n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド (DDM) で精製された MsbA の質量スペクトルは幅広のこぶであり (補足図 1)、共精製された一連の低分子汚染物質に対応する、非常に不均一なサンプルであることを示しています。 4500 m/z 付近を中心とする、下にあるこぶを装飾する鋭い質量スペクトル ピークは、高活性化の非天然条件下でのホモ二量体の解離から生じる単量体 MsbA に対応します。 タンパク質精製を最適化するために確立された界面活性剤スクリーニング法を採用した後（補足注1を参照）37、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル（C10E5）界面活性剤に可溶化したMsbAサンプルは、十分に分解された質量スペクトルを示しました（図1b）。 ADP の存在によって明らかなように、MsbA サンプルも時間の経過とともに ATP を加水分解しましたが、触媒活性を無効にする E506Q 変異を含む MsbA は ATP を代謝しませんでした（補足図 1c-d）。 興味深いことに、二量体MsbAおよび1〜3個の〜65 Da付加物の付加に対応する、異なる分子種が測定されます（図1dおよび補足表1）。 誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)を使用したMsbAサンプルの分析により、結合付加物が銅であることが特定されました(補足表2〜3)。 MsbAに銅(II)を添加すると、2つの結合部位が飽和しました(図1e)。 過剰な銅(II)の除去または銅(II)キレート剤であるトリエンチン39の添加により、MsbAに結合する金属の量が減少しました(補足図2)。 これらの結果は、MsbA がサブユニットごとに 1 つの高親和性銅(II) 結合部位を持っていることを明らかにしています。

MsbA と脂質の相互作用をより深く理解するために、さまざまな脂質に結合する MsbA の平衡結合定数を決定しました。 これらの研究では、1,1',2,2'-テトラオレオイル-カルジオリピン (TOCDL、72:4) またはホスファチジン酸 (PA)、ホスファチジルコリン (PC)、ホスファチジルエタノールアミン (PE)、ホスファチジルグリセロール (PG)、およびホスファチジルセリンを選択しました。 (PS) アシル鎖組成、1-パルミトイル-2-オレオイル (PO、16:0-18:1) を含む。 また、MsbA ATPase 活性を刺激することが知られている LPS 前駆体である 3-デオキシ-D-マンノ-オクト-2-ウロソン酸 (Kdo)2-リピド A (KDL) も含めました 22,23,24。 PC を除いて、これらの脂質は大腸菌に含まれています 40。 銅(II)を部分的および完全にロードしたMsbAを各脂質で滴定し、その後、それらのネイティブの質量スペクトルを記録しました（補足図3〜6）。 アポのモル分率と MsbA の脂質結合状態は、デコンボリューションされた MS データから抽出され、N 番目の結合イベントの平衡解離定数 (KDN) を決定するために使用されました (補足表 4-5)。 銅（II）をロードしたMsbAは、POPAおよびPOPSに対する結合親和性の統計的に有意な向上をもたらしました（図1c〜fおよび補足図7）。 銅(II)がロードされたMsbAに対する2つの最も強固な結合脂質は、TOCDL (KD1 = 1.6 μM) およびKDL (KD1 = 0.6 μM)でした。 POPG 結合親和性は、MsbA の銅 (II) 結合状態にほとんど依存しませんでした。 つまり、これらの結果は、MsbA が脂質に選択的に結合するだけでなく、トランスポーターに結合する銅(II) の程度にも依存することを示しています。

MsbA の 2 つの推定金属結合部位が以前に報告されています 41。 推定部位の1つ（H562AおよびH576A）の変異は、銅（II）結合を廃止しませんでした（補足図2）。 どちらも銅42に優先的に配位することが知られているヒスチジン残基とシステイン残基に焦点を当ててMsbA構造を注意深く検査した結果、すべてのMsbA構造においてN末端ヒスチジンが観察されないことに気付きました。これはおそらく柔軟なリンカーまたは異なる配列が原因であると考えられます。構造物。 MsbAの最初の4残基（Met-His-Asn-Asp）を除去すると、銅（II）の結合が消失し（図2a）、金属結合部位がN末端に固定されました。 追加の研究では、切断された銅(II)を含まないタンパク質は、界面活性剤でもプロテオリポソームでもATPアーゼ活性の変化を示さないことが示されています(補足図8)。 一部の細菌タンパク質では開始Metが除去されていることが示されているため43、C末端アフィニティータグを使用してMsbAを発現および精製したところ、銅(II)にも結合できる無傷のN末端を保持していることがわかりました(補足図2)。 興味深いことに、MDシミュレーション44は、さまざまな構造のMsbAのN末端が内膜の近く、およびLOSが内部空洞に入る前に通過できる領域に位置していることを示しています（図2bおよび補足図9）。

ネイティブの質量スペクトルと、4 つの N 末端残基を削除した MsbA のデコンボリューション。 切断されたトランスポーターには銅(II)は結合しません。 b 16:0 PC (DPPC) 二重層における MsbA の分子動力学シミュレーションからのスナップショット (MemProtMD44 からダウンロードされた PDB 6BPP)。 DPPC はスティック表現 (灰色) で表示されます。 タンパク質は、残基 4 ～ 8 がピンク色で漫画表示されています。 黄色のボックスは、内膜に対する N 末端の位置を強調表示します。 c 銅(II)を配位する緑色蛍光タンパク質(GFP)に融合されたMsbAのN末端(残基1〜4)の構造。 N 末端ペプチドは棒で示されており、水 (青) と銅 (II) は球として示されています。 結合は破線 (リモン) で示されます。 異常な差分ピークはマゼンタで示され、15 シグマで輪郭が描かれています。 明確にするために、GFP の構造は省略されています。 d GHK-銅(II)複合体を使用した銅(II)に結合したN末端MsbAペプチドのアライメント(CCDC-809108、Cαは紫色)。

構造決定を容易にするために、MsbA の N 末端配列を、容易に結晶化することが知られているタンパク質にグラフトしました。 ネイティブMSは、可変長の結合銅(II)および単量体のMsbAのN末端の断片を含むこれらの融合タンパク質を示します(補足図10)。 MsbA の残基 1 ～ 4 を含む緑色蛍光タンパク質 (GFP) 融合体の 1 つは、X 線グレードの結晶を生成し、解像度 2.15 Å での構造決定につながりました (補足表 6)。 N末端の分解された電子密度は、結合した銅イオンの強い異常なシグナルとともに観察され（図2cおよび補足図11）、天然に存在する銅（II）配位GHKペプチドの構造と同様の構造を採用しています。血漿中に存在する高親和性銅(II)キレート剤が見出される(図2d)45。 銅(II)は、M1のアミン、アミドおよびH2の側鎖から構成される平面配位子と擬似八面体配位をとります。 追加の相互作用は、対称関連分子のD197'の側鎖によって形成され（補足図10c）、C末端カルボン酸であるGHK銅(II)構造と同様です。 銅(II)の軸配位子は水であり、そのうちの1つは銅と側鎖およびN3のアミドとの間に架橋を形成します。 この相互作用は結晶接触を表し、配位は軸方向の水中のGHKペプチドや金属イオンへの水架橋に関与するN3とは異なります（図2d）46。 2 つの構造間の違いは、3 番目の位置が可変である可能性があることを示唆しています。 N末端が内側リーフレットに近接していることを考えると（図2bおよび補足図11）、銅（II）結合構造は脂質頭部基と結合し、その結果脂質結合親和性が向上する可能性があります。 ABCトランスポーター配列の分析により、400を超えるタンパク質が2番目の位置にヒスチジンを含み、その中にはMHKのN末端配列を持つものも含まれており、他のABCトランスポーターと関連性がある可能性があることが明らかになりました。

脂質結合親和性に対する MsbA 立体構造の影響を決定するために、アデノシン二リン酸 (ADP) およびバナジン酸塩 (VO4) を含む開いた OF 立体構造にトラップされた MsbA を使用して、同様の実験を実行しました。 ネイティブ質量測定は、トランスポーターの各サブユニットが銅（II）、ADP、およびVO4分子に結合していることを示しています（図3aおよび補足表1）。 解離定数により、開いたOF構造のMsbAは、脂質のサブセットに対してより高い脂質結合親和性を示すことが明らかになりました（図3d、補足図12〜14、および補足表7）。 たとえば、0.4 μMのKDLの存在下では、バナジン酸塩でトラップされたMsbAは最大2つの脂質に結合しますが、トラップされていないタンパク質は1つのKDLのみに結合します（図3b-c）。 特に、KDL (KD1 = 0.3 μM) に対する結合親和性は、トラップされていないタンパク質と比較して 2 倍大幅に増加しました (図 3d)。 興味深いことに、後続の各脂質結合イベントに対する KD の変化は大幅に減少しており、これは強い正の協力性を示しています。 POPC と POPE の結合は、銅(II) が部分的に負荷された MsbA の結合を思い出させます。 POPA および POPG は、全体的に結合親和性のわずかな増加を示しました。 まとめると、これらの結果は、MsbA の異なる立体構造状態が異なる親和性で脂質に結合することを示しています。

ADP・VO4で0.4μM KDLの存在下でトラップされたMsbAの代表的な質量スペクトル。 b パネル a に示す質量スペクトルのデコンボリューション。 c 同量の KDL の存在下での、トラップされていない MsbA のデコンボリューションされた質量スペクトル。 MsbA への KDL 結合の大幅な減少が観察されます。 d ADPおよびバナジン酸塩でトラップされたMsbAへの個々の脂質結合イベントのKD値。 平均値と標準偏差 (n=3、生物学的反復) が報告されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

KDL は他の脂質よりも高い親和性で銅(II) 結合 MsbA に結合するため、クライオ用 C10E5 中で 2 倍モル過剰の KDL (124 μM) の存在下で ADP とバナジン酸塩 (62 μM) でトラップされた MsbA を調製しました。 - 電子顕微鏡 (cryoEM) 研究。 複合体の構造は、3.6 Åの分解能で決定されました（図4a、補足図15〜16、補足表8、および補足注2）。 この構造は、ネズミチフス菌由来のバナジン酸塩でトラップされたMsbAの構造に似ていますが、主にTMDにおいて以前に報告されたバナジン酸塩でトラップされた閉塞MsbA構造17,47とは異なります（補足図17）。 内膜の細胞質小葉内の領域のTM5を中心に追加の密度が観察され、KDLをこの密度に直接モデル化できます（図4a）。 KDL の位置は、内部結合部位 6,17 および内膜の反対側に位置する推定上の外部結合部位 19 とは異なります (図 5)。 MsbA の静電表面は、KDL の頭部基が大きな基本パッチに結合していることを示しています (図 4b)。 MsbAの疎水性表面と相互作用するKDLのアシル鎖をモデル化することができた(図4c)。 KDL と MsbA の間には、2779 Å2 の界面面積を持つ広範な相互作用が形成されます。 LOSの特徴的なホスホグルコサミン（P-GlcN）置換基は、一方の側ではR238、もう一方の側ではR188およびK243によって配位されています（図4d）。 さらに、R236、Q240、およびK243は、LOSのKdoグループの1つと相互作用します（図4d）。 また、ここで使用される KDL の濃度は、MsbA 結合 G907 または TBT1 の構造に使用される濃度よりもはるかに低いことにも注目します。この場合、それぞれの薬物の 1 mM および 400 μM が使用されます 6,8。 これにより、外部部位への KDL の特異的結合がさらに強化されます。 さらに、NBDにはADP・VO4の明確な密度があり、保存された残基のネットワークによって調整されています（図4eおよび補足図18）。 つまり、ここで特定された外部 KDL 結合部位は、MsbA 機能の調節に役割を果たしている可能性があります。

KDLと複合体を形成したMsbA(ADP・VO4)のクライオEM再構成(3.6Å)。 KDL の密度は黄色で示され、MsbA サブユニットはピンクと青色で示されます。 b クーロン静電位 (ChimeraX62 によって計算されたスケール バー -10 ～ +10) は、負電荷と正電荷をそれぞれ赤と青で色付けされます。 KDL および相互作用する残基は、ボールとスティックの表現で示されています。 c MsbA は、それぞれ青と金色の親水性表面と疎水性表面で示されています。 d MsbA に結合する KDL のさまざまなビュー。 KDL および相互作用する残基をスティック表示で示します。 結合は黄色の破線で示されます。 残留物にはラベルが付けられています。 e dに記載されている結合ADP・VO4および相互作用残基の図。

構造は漫画表現で示されており、脂質 (存在する場合) はオレンジ色の球で示されています。 2 つのビュー (0 ° と 90°) が表示されます。 a 外部結合部位 (本研究)、b 内部結合部位 (PDB 6BPL)6,17、および c 推定外部結合部位 (PDB 6BL6)19,64 を示します。 パネル c では、密度は脂質をモデル化するには十分に明確ではなく、推定部位は赤い円で示されています 19。 d 細菌系統全体からの 258 個の MsbA 配列のアラインメントに基づく、KDL 相互作用残基 (83、87、188、236、238、240、および 243) の配列ロゴ。

ここで明らかになった独特の KDL 結合部位は、MsbA の進化的に保存された特徴を明らかにします。 LOSの特徴的なP-GlcN置換基と結合する残基（R188、R238、およびK243）は保存されています（図5d）。 同様の相互作用が、MsbA6,17 の内部 LOS 部位と、LPS ABC トランスポーターである LptB2FG の LPS 認識でも観察されています 48。 KDLのKdo基を調整する他の残基（R236およびQ240）も保存されています（図5d）。 グラム陰性菌のほとんどの LOS は大腸菌に見られる KDL 分子に似た KDL 分子を合成します 3。残基の保存と KDL との相互作用により、これが他のトランスポーターと比較した MsbA のユニークな特徴として確立されます。 さらに、KDL ヘッドグループに寄り添う大きな基本パッチは Kdo グループを超えて広がり、LOS のコアオリゴ糖である糖脂質 MsbA フリップにさらに関与する可能性があります。 この基本的なパッチは他の MsbA にも拡張される可能性が高く、細菌ごとに構造が異なる他の脂質を含む LOS の認識に重要です。

KDL 結合に影響を与えるように操作された一連の MsbA 変異体が評価されました。 MsbAY87F、R238Aなど、一部のMsbA変異タンパク質は発現および精製できましたが、生化学的に不安定であり、バナジン酸塩での処理後にトランスポーターの切断が観察されました（補足図19）。 R188AおよびK243A変異を含むMsbA（MsbAR188A、K243A）は、KDLのP-GlcN置換基の1つとの相互作用を破壊するように操作され、生化学的に安定であり、KDの決定に適していました（図6a〜cおよび補足図20）。 トラップされていないタンパク質では、KD1 は 2 倍に増加し、KD2 は 5 倍に増加しました。 トラップされた状態では、KD1 と KD2 も両方とも統計的に 2 倍以上増加しました。 MsbA はいくつかの脂質によって刺激されることが知られている 22、23、24、49 ため、脂質の非存在下および存在下での MsbA の ATPase 活性を測定しました (図 6d)。 野生型 MsbA は、他の研究者によって観察されたレベルで KDL によって刺激されました 17,22。 しかし、完全な大腸菌 R2 型コア 50 を持つ LOS である RaLPS (LRa) は、MsbA ATPase 活性をより高度に刺激しました (図 6d)22。 以前の報告 22 と一致して、KDL に似ているが Kdo 置換基を欠いているリピド A (LA) は、程度は低いものの MsbA を刺激し、Kdo 基の重要性が強調されました。 MsbAR188A、K243Aは、脂質の種類とは無関係に、統計的に有意な刺激の減少を示しました（図6d）。 内部部位での結合を破壊するように操作された、R78AおよびK299A変異を含むMsbA（MsbAR78A、K299A）の脂質誘発刺激も評価しました（図5b）。 MsbAR78A、K299AはLAおよびKDLによる刺激を示さなかったが、活性はLRaによって野生型タンパク質と同じレベルまで刺激された（図6d）。 次に、MsbA構造のKDLを配位する残基を検査しました（図6eおよび補足図21）。 R188 を除いて、KDL 相互作用残基は同様の位置にあります。 しかし、(閉塞および開放) OF 状態では、TM4 は他の残基に向かう方向に約 12 Å 移動し、R188 が KDL の P-GlcN と結合するようにプライミングされます。 この追加の相互作用は、KDL 結合親和性の強化を説明します。 これらの結果を総合すると、外部 KDL 結合部位が MsbA ATPase 活性のアロステリックな刺激に直接的な役割を果たしていることがわかります。

a 0.4 μM KDL 存在下での 0.3 μM MsbAR188A,K243A のデコンボリューションされた質量スペクトル。 b パネル a と同じ濃度の KDL を使用した 0.4 μM バナジン酸塩トラップ MsbAR188A,K243A のデコンボリューションされた質量スペクトル。 c野生型および変異型MsbAへのKDL結合のKD値。 d 5μMリピドA（LA）の存在下および非存在下でのMsbA、MsbAR188A、K243A、およびMsbAR78A、K299AのATPアーゼ活性（*p = 0.047; 0.011）、KDL（**p = 0.008; 0.005、*p = 0.019） )、または Ra-LPS (LRa) (**p = 0.004; 0.009)。 統計的有意性を検定するために、両側スチューデント t 検定を使用しました。 e TM5 の領域に対するさまざまな構造のアラインメント、残基範囲は 230 ～ 250 です。示されている最初の 4 つのパネル (左から右) は、apo (このレポート)、G907 結合 (PDB 6BPL)、およびバナジン酸塩でトラップされたものに対応します。閉塞された（PDB 7BCW）または開いた（このレポート）MsbA 構造。 一番右のパネルは、4 つの構造すべてをオーバーレイしたものです。 平均値と標準偏差 (n=3、生物学的反復) が報告されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

要約すると、ネイティブ質量分析データは、MsbA が銅(II) と共精製することを明らかにしています。この観察は、従来の方法では気づかれないままであり、タンパク質と脂質の相互作用は、銅(II) 結合および銅 (II) の立体構造によって直接影響を受けます。トランスポーター。 構造研究では、MsbA の N 末端が GHK ペプチドと同様の方法で銅(II) を配位していることが示されています。 MsbA への銅(II)の結合は脂質結合に影響を与え、N 末端は二重層の近くに位置しており、そこでおそらく脂質頭部基と相互作用します。 より広範には、銅(II)結合は、銅(II)レベルとLPS生合成との共役など、調節的な役割を果たしている可能性があり、さらなる研究が必要である。 別の構造は、ATPアーゼ活性のアロステリック調節因子であり、MsbAの保存された特徴である、別個の外部KDL結合部位を明らかにする。 突然変異誘発の研究では、この外側のアロステリック部位は、LA や LRa などのヘキサアシル化リピド A 種に対しても感受性があることが証明されています。 これらの結果は、MsbA のフィードフォワード活性化メカニズムの有力な証拠を提供します。MsbA は、ピルビン酸キナーゼ 51 について最もよく説明されている生合成経路におけるまれな制御原理であり、細胞質 LOS およびその前駆体の細胞産生に合わせて MsbA 活性を調整します。

msbA 遺伝子 (UniProt P60752) および pCDF-1b プラスミド (Novagen) は、それぞれ大腸菌ゲノム DNA および精製プラスミドから Q5 High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (New England Biolabs, NEB) を使用するポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって増幅されました。 プライマーはオンラインの NEBuilder Assembly Tool (NEB) を使用して設計され、増幅産物はメーカーのプロトコールに従って HiFi DNA Assembly (NEB) の前にゲル精製されました。 得られた構築物である pCDF-MsbA は、N 末端 TEV 切断可能な His6 融合タンパク質を含む MsbA を発現しました。 MsbA の変異型を生成するために、オンライン ツール NEBaseChanger (NEB) を使用してプライマーを設計し、メーカーのプロトコルに従って KLD 酵素ミックス (NEB) を使用して変異体を導入しました。 また、ＭｓｂＡを修飾ｐＥＴ１５プラスミドにクローン化し、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼで切断可能なスーパーフォルダーＧＦＰ５２へのＣ末端融合、その後に６×Ｈｉｓタグを有するＭｓｂＡを発現させた。 MsbA の N 末端配列を、pCDF-MsbA プラスミドにサブクローニングし、MsbA の残基 1 ～ 8 を保持することにより、MBP、スーパーフォルダー GFP52 および T4 リゾチームに移植しました。 同様の融合戦略が GHK ペプチドに対して行われています 53。 MsbA N末端の切断は、製造業者のプロトコールに従ってKLD酵素ミックス(NEB)を使用して行われた。 構造決定に成功した GFP 融合体には、TEV プロテアーゼによる MHNDKGEELF 切断後の N 末端配列があり、MsbA 配列に下線が付けられました。 すべてのプラスミドは DNA 配列決定によって確認されました。 この研究で使用したプライマーは、ソース データ ファイルにあります。

野生型および変異型のMsbA発現プラスミドを大腸菌（DE3）BL21-AIコンピテント細胞（Invitrogen）に形質転換し、OD600nmが0.6〜1.0になるまで37℃でインキュベートし、その時点で培養物を最終濃度の0.5 mM IPTG (イソプロピル β-D-1-チオガラクトプリアノシド) および 0.2% (w/v) アラビノース。 培養物を 25 °C で一晩誘導しました。 次に、培養物を 4500 × g で 12 分間収集し、得られたペレットを 20 mM Tris、300 mM NaCl、pH 7.4 に再懸濁し、Roche cOmplete プロテアーゼ阻害剤カクテル タブレットを補充しました。 懸濁液を、氷上で２５，０００ｐｓｉで動作するＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ－１１０Ｐマイクロフルイダイザー中で溶解した。 ライセートを 40,000 × g で 20 分間遠心分離し、得られた上清を 100,000 × g で 2 時間遠心分離しました。 得られたペレットを回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．４中でホモジナイズした。 膜溶液を 1% (w/v) DDM で抽出し、4 °C で一晩回転させました。 次に、抽出液を 40,000 × g で 10 分間遠心分離し、得られた上清に 10 mM イミダゾールを添加し、0.45 μm シリンジフィルターで濾過しました。

抽出された物質は、MsbA に対する各界面活性剤の脱脂能力を決定するために、広範な界面活性剤スクリーニング 37 に供されました。 つまり、Hisタグ付きMsbAを、 2x 臨界ミセル濃度 (CMC) の DDM を加え、2x CMC DDM バッファーを含む 5 カラム容量 (CV) の NHA で洗浄しました。 次いで、結合タンパク質を、10×CMCの様々な界面活性剤(Anatrace)を補充した2×CMC DDM緩衝液を含有する10CVのNHAで処理した。 次いで、カラムを５ＣＶのＮＨＡ－２×ＣＭＣ ＤＤＭ緩衝液で再平衡化し、５００ｍＭのイミダゾールを補充した２×ＣＭＣ ＤＤＭ緩衝液を含有する２ＣＶのＮＨＡで溶出した。 ネイティブ質量分析により脱脂の程度をチェックするために、メーカーのプロトコールに従って、溶出液をMicro Bio-Spin P-6ゲル遠心分離カラム（Biorad）により200 mM酢酸アンモニウム、2x CMC DDM、pH 7.4に緩衝液交換した。 最適な洗剤洗浄 (NG) による測定および精製後、タンパク質を HiPrep 26/10 脱塩カラム (GE Healthcare) で NHA-2x CMC DDM に緩衝液交換して戻しました。 次にサンプルを社内で製造した TEV プロテアーゼで室温で一晩処理して N 末端 His タグを除去し、TEV 処理中に 10 mM β-メルカプトエタノールを添加しました。 消化された物質を、NHA-2x CMC DDMで平衡化したNi-NTAアガロースに通し、切断された物質を含むフロースルーを収集した。 遠心濃縮器 (Millipore、分子量カットオフ 100 kDa) を使用して物質を濃縮し、続いて 20 mM HEPES、200 mM NaCl、10% (v/v) で平衡化した Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) カラムに注入しました。 ) グリセロールおよび 2x CMC C10E5。 二量体MsbAを含むピーク画分をプールし、-80℃で急速冷凍しました。

銅(II)結合が減少したMsbAの場合、Ni-NTAビーズを使用する精製ステップで、すべての緩衝液およびMsbA溶液にさらに1 mM MgCl2を添加しました。 銅(II)飽和MsbAは、20μM酢酸銅(II)を添加し、次いでBio-Spinカラムを使用して緩衝液交換して過剰の銅(II)を除去することによって得た。 バナジン酸塩によって捕捉されたMsbAは、ATPおよびMgCl2をMsbAに添加して両方の最終濃度が10mMになるように添加し、次いで室温で10分間インキュベートすることによって得た。 インキュベーション後、バナジン酸塩（pH 10）を最終濃度 1 uM になるように添加し、続いて 37 °C で 10 分間インキュベートしました。 ネイティブ MS 研究のために、Bio-Spin カラムを使用して MsbA サンプルを 2x CMC C10E5 を補充した 200 mM 酢酸アンモニウムに緩衝液交換しました。 Cryo-EM 研究用の MsbA サンプルを調製するために、MsbA およびトラップされた MsbA に銅(II) をあらかじめロードし、グリセロールを含まない 200 mM NaCl、20 mM HEPES および 2x CMC C10E5 で平衡化した Superdex 200 Increase 10/300 GL サイズ排除カラムによって精製しました。 MsbAを含むピーク画分をプールし、8 mg/mLに濃縮し、その後、KDLと1:2のモル比(1つのMsbAサブユニットに対して1 KDL)で混合した。

サンプルは社内で製造された金コーティングされたガラスキャピラリー 37 にロードされ、エレクトロスプレーによって拡張質量範囲 (EMR) を備えた Thermo Scientific Exactive Plus Orbitrap にイオン化されました。 自然質量分析の場合、機器は次のように調整されました。ソース DC オフセット 25、注入フラットポール DC 8.0 V、フラットポール間レンズ 7、ベントフラットポール DC 6.0、転送多極 DC 2、C トラップ入口レンズ 2、トラップガス圧力は 6.0、ソース内 CID は 60.0 eV、CE は 100、スプレー電圧は 1.70 kV、キャピラリー温度は 200 °C、最大注入時間は 200 ms です。 質量スペクトルは、解像度 17,500、マイクロスキャン 1、平均化 100 の設定で取得されました。

脂質は前述のとおりに調製しました54。クロロホルムに溶解した脂質を真空下に置いた窒素流下で一晩乾燥し、その後水に溶解しました。 MsbAの濃度は、ウシ血清アルブミンを標準としてDCタンパク質アッセイ(BioRad)を使用して測定した。 MsbA をさまざまな濃度の脂質とともにインキュベートし、2x CMC ラウリルジメチルアミン オキシド (LDAO) を補充した 200 mM 酢酸アンモニウムと 1:1 の体積比で混合しました。 データ取得前に、サンプルをナノエレクトロスプレーイオン化源チャンバー内で 1 分間インキュベートして平衡に達させました。 これらのサンプルは、上記と同じ設定で動作する Orbitrap Exactive Plus EMR 質量分析計 (Thermo Scientific) で分析されました。 各滴定イベントの質量スペクトルは 3 回取得されました。 UniDec55 を使用して質量スペクトルをデコンボリューションし、結果として得られた apo および脂質結合タンパク質のピーク強度を決定しました。 各種の相対存在量は、ピーク強度を総強度で割って、独立した実験ごとにモル分率に変換することによって決定されました。 N 番目の脂質 (Ln) に結合する MsbA (P) については、次の逐次脂質結合モデルを適用しました。

どこ：

特定の種のモル分率を計算するには:

滴定における各滴定液について、遊離脂質濃度は次のように計算されました。

逐次脂質結合モデルは、疑似 \({\chi }^{2}\) 関数の最小化によってモル分率データにグローバルに適合しました。

ここで、n は結合したリガンドの数、d は実験的なモル分率データポイントの数です。

MsbA のサンプルは、誘導結合プラズマ質量分析法による元素分析のためにテキサス A&M 大学の元素分析研究所に提出されました。 NexION ICP 質量分析計 (PerkinElmer) を、補足表 2 に示す操作パラメーターで使用しました。

POPC (Avanti) をクロロホルムに再懸濁し、窒素ガス流下で乾燥させた。 フィルムをペンタンで洗浄し、再度窒素ガス流下で乾燥させた。 脂質フィルムをデシケーター内で一晩保存し、再水和緩衝液（20 mM HEPES pH 7.4、150 mM KCl）中で最終濃度20 mMまで再水和し、1時間時々撹拌してから-80℃で保存しました。 リポソーム混合物 (約 150 μL) を再水和緩衝液で半分に希釈し、100 nm ポリカーボネート膜を備えたミニ押出機 (Avanti Polar Lipids) を使用して、溶液が半透明になるまで押し出しました。 次いで、押し出されたリポソームを、等しい体積の 2 つの異なる部分に分離しました。1 つは野生型タンパク質用、もう 1 つは変異型タンパク質用です。 次いで、押し出されたリポソームを等量の可溶化緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＫＣｌおよび２０ｍＭ ＤＤＭ）で可溶化し、室温で３０分間または透明になるまで回転させた。 次に、MsbA サンプルをタンパク質と脂質の比 1:100 (w/w) で添加し、室温で 1 時間回転させました。 BioBeads をリポソームに添加し、4 °C で一晩回転させて界面活性剤を除去しました。

MsbA の ATPase 活性は、マラカイト グリーン アッセイの改良版に従って測定されました 56。 完全に脱脂された (apo) タンパク質の場合、400 nM の MsbA (1x CMC C10E5 および 1x CMC LDAO を補充した 200 mM 酢酸アンモニウム中) を 5 mM MgCl2 および 200 μM ATP と 37 °C で 12 分間インキュベートしました。 KDL を使用したタンパク質の分析では、脂質を最終濃度 5 μM でサンプルに添加しました。 エンドポイントサンプルを 3、6、9、12 分で収集し、次の成分を含むマラカイトグリーン溶液の添加で停止しました: 0.045% (w/v) マラカイトグリーンと 4.2% (w/v) アンモニウムの 3:1 混合物4 N HCl、0.04% (v/v) Triton X-100 (最終濃度) で調製されたモリブデン酸塩。 次いで、３４％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウムを添加して、着色反応を停止させた。 クエンチした反応物を室温で３０分間インキュベートし、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ＬａｂＴｅｃｈ）で６５０ｎｍの吸光度を測定した。 ATPの加水分解速度は、3分、6分、9分、および12分で収集されたサンプルの吸光度の傾きをプロットすることによって得られました。

初期結晶化試験は、ハンギングドロップで Mosquito LCP (TTP Labtech) 結晶化ロボットを使用して、濃度 1 mM (490 nm での吸光係数 39.2 × 103 M−1 cm−1 を使用) 52 で GFP 融合タンパク質に対して実行されました。プレートを20℃に保ちます。 結晶は指数条件 C5 (60% Tacsimate pH 7.0) で成長し、Tacsimate pH 7.0 の濃度を 70% に増加させることによってさらに最適化されました。 結晶は、100% Tacsimate pH 7.0 を使用して凍結保護されました。 単結晶は、液体窒素中で急速冷凍する前に、CrystalCap HT Cryoloops (Hampton Research) を使用してマウントされました。 初期回折データは、Riraku Raxis-IV++ を使用して社内で収集されました。 初期段階は、PDB コード 2B3P による分子置換を使用して決定されました。 モデルの改良と構築は、Phenix57 と Coot58 を使用して実行されました。 異常データは、ビームライン 24-ID-C のアドバンスト フォトン ソースで 1.378 Å の波長を使用して収集されました。 構造は Phenix AutoSol プログラムを使用した SAD フェーズによって決定できますが、社内データから構築されたモデルは分子置換に使用され、その後モデルの構築と改良が行われました。

ガラス化は、8 °C、湿度 100% で動作する Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher) を使用して実行されました。 合計 3.5 μL のサンプル (8 mg/mL 銅担持 MsbA、アポまたは 200 mM NaCl、20 mM HEPES pH 7.4 中の ADP バナジン酸塩でトラップ、2x CMC C10E5 を添加) を穴あきカーボン グリッド (Quantifoil 300) に適用しました。メッシュ Cu 1.2/1.3) 30 秒間グロー放電。 サンプルには 2 倍モル過剰の KDL が含まれていました。 標準の Vitrobot 濾紙 (Ted Pella、47000-100) を使用して、ブロッティング力 1 でグリッドを 5 秒間ブロットし、液体エタンに浸しました。

最適化されたグリッドは、データ収集のためにシカゴ大学の高度電子顕微鏡施設に送られました。 データセットは、K3 直接検出器カメラを備えた 300 kV で動作する Titan Krios 電子顕微鏡を使用して、ムービー スタックとして収集されました。 画像は、イメージシフトによる超解像度計数モードで公称倍率 81,000 倍で記録されました。 総露光時間は 4 秒に設定され、フレームは 0.1 秒ごとに記録され、単一スタックで 40 フレームとなり、総露光量は約 50 電子/Å2 になります。 デフォーカス範囲は−１．０〜−２．５μｍとした。 データ収集パラメータの詳細については、補足表 8 を参照してください。

収録した動画はMotionCor259による動き補正を施しました。 その後の処理は、cryoSPARC60 で実行されました。 詳細なデータ処理フローを補足図15（バナジン酸トラップMsbA）および補足図22（開いた、内向きMsbA）に示します。 ステージのドリフトとスタック画像の異方性の動きは、まずパッチベースの動き補正によって補正されました。 各顕微鏡写真の CTF パラメーターは、パッチベースの CTF 推定によって決定されました。 バナジン酸塩でトラップされた MsbA の場合、粒子はブロブ ピッカーから生成されたテンプレートを使用して選択されました。 開いた内向きの MsbA の場合、最終的な粒子セットは、以前の再構成の 3D モデルから生成されたテンプレートを使用して選択されました。 どちらのデータセットでも、粒子は 2 回の 2D 分類によってクリーン化されました。 3 つの初期モデルは、ab initio 再構築を使用して残りの粒子から生成されました。 粒子は、3 つの初期モデルに基づく不均一な精製によってさらに分類されました。 バナジン酸塩でトラップされた MsbA については、粒子ごとのデフォーカスと CTF の最適化による不均一な精製に最適な粒子クラスが選択され、C2 対称性が課せられ、3.6 Å で分解された最終マップが得られました。 オープン MsbA の場合、C2 または C1 対称性を課した不均一な精製に最適な粒子クラスが選択され、それぞれ 3.88 Å と 4.06 Å で分解された最終マップが得られました。 画像処理統計の詳細については、補足表 8 を参照してください。

以前に報告された大腸菌由来の ADP バナジン酸塩を含む MsbA の構造 17 (PDB 5TTP) は、Chimera61 を使用してクライオ EM マップにドッキングされました。 モデルは Coot58 を使用して手動で改良されました。 Phenix57 は、KDL の座標ファイルと拘束ファイルを生成するために使用されました。 最終モデルは、二次構造拘束とラマチャンドラン拘束を備えた Phenix を使用して、複数回の実空間改良を経ました。 ジオメトリの外れ値は Coot で手動で修正されました (各ラウンド後)。 モデル改良の最終ラウンドの統計とモデルの幾何学形状を補足表 9 に報告します。図は、ChimeraX62 および Pymol (Schrödinger LLC.、バージョン 2.1) を使用して生成されました。 モデル統計の詳細については、補足表 9 を参照してください。

保存解析のための配列は、NCBI Blast および入力として大腸菌 MSBA タンパク質を使用して収集されました。 細菌全体にわたる広範な表現を取得するために、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、アルファプロテオバクテリア、イプシロンプロテオバクテリア、FCB クレード、および桿菌の MSBA 配列を個別に検索しました。 次に、配列を Muscle 3.83 と整列させました。 大腸菌配列に存在しない配列によって生じるすべてのギャップを除去し、カスタム Python スクリプトを使用して KDL とインターフェースする部位を抽出しました。 これらのサイトのみを含むサブアライメントをウェブログ サーバー (https://weblogo.berkeley.edu/) で使用して、シーケンス ロゴを生成しました。 ABC トランスポーターの N 末端配列を分析するために、20,000 を超える MsbA 配列が UniProt からダウンロードされました。 BioPython63 を利用した Python スクリプトは、MH で始まる の N 末端配列を含む配列を解析しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

GFP に融合され銅(II)に結合した MsbA の N 末端フラグメントの結晶構造の原子座標と構造因子が、アクセッション コード 8DHY (銅(II) 結合 MsbA) でタンパク質データ バンク (PDB) に寄託されました。 GFPに融合したN末端ペプチド）。 MsbA のクライオ EM 構造とマップは、次のように PDB および EMDB に登録されています: 8DMO (開いた、内向きの MsbA) および EMD-27545 (開いた、内向きの MsbA)。 および 8DMM (バナジン酸塩でトラップされた MsbA および KDL に結合) および EMD-27544 (バナジン酸塩でトラップされた MsbA および KDL に結合)。 この研究で使用された以前に報告されたタンパク質構造は次のとおりです。 5TTP (閉塞された、外向きの MsbA)。 6BPP (G092と複合体を形成したMsbA); 6BPL (G907 および LPS と複合体を形成した MsbA); 7BCW (バナジン酸トラップMsbA); 6BL6 (開いた、内側を向いたネズミチフス菌 MsbA); 3B60 (開いた外側を向いたネズミチフス菌 MsbA); および 2B3P (スーパーフォルダー GFP)。 ネイティブ MS データは Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7268757) に寄託されています。 ソース データ ファイルはこのペーパーに付属しています。 この原稿に関連するその他のデータは、ご要望に応じて入手可能です。

個々の平衡結合定数を決定するための Python コードは、https://github.com/LaganowskyLab で入手できます。

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元素分析については元素分析研究所の Bryan Tomlin 氏、データ収集に関する有益な議論については APS の Jonathan Schuermann 氏と Igor Kourinov 氏に感謝します。 また、MsbA リポソームの調製に協力してくれた Lauren Stover に感謝します。 この研究の一部は、高度光子源 (DE-AC02-06CH11357) のノースイースタン共同アクセス チーム ビームライン (P30 GM124165) で実施された研究に基づいています。 この研究は、助成金番号 (AL への DP2GM123486、R01GM121751、R01GM139876、R01GM138863 および RM1GM145416、MZ への R35GM143052、DR への P41GM128577) およびマックス プランク協会から GKAH の下で国立衛生研究所 (NIH) からも支援されました。 クライオ EM データ収集にご協力いただいたシカゴ大学先端電子顕微鏡 (RRID:SCR_019198) のスタッフに感謝します。 NIH (S10OD028655) から資金提供された Beagle3 HPC クラスターのコンピューティング リソースを提供してこの研究を支援していただいたシカゴ大学リサーチ コンピューティング センターに感謝します。

チャールズ・パッキアナサン

現在の住所：ウォルター・リード陸軍研究所、パイロット生物生産施設、シルバースプリング、20910、メリーランド州、米国

テキサス A&M 大学化学科、カレッジステーション、77843、TX、米国

Jixing Lyu, Tianqi Zhang, Samantha Schrecke, Nicklaus P. Elam, Charles Packianathan, David Russell & Arthur Laganowsky

シカゴ大学生化学および分子生物学部、シカゴ、60637、イリノイ州、米国

チャン・リウ & ミンレイ・チャオ

マックス・プランク陸生微生物学研究所およびマールブルク大学化学科（ドイツ、マールブルク）

ゲオルク・KA・ホッホベルク

合成微生物学センター (SYNMIKRO)、マールブルク大学化学科、マールブルク、ドイツ

ゲオルク・KA・ホッホベルク

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JL と AL が研究を計画しました。 JL、TZ、NEおよびCPはMsbAを発現および精製した。 JL は質量分析実験を実施しました。 JL と TZ は機能アッセイを実施しました。 JL、MZ、DR、AL がデータを分析しました。 CL と MZ はクライオ EM データを収集および処理しました。 SS、JL、TZ、および AL は X 線結晶構造解析を実施しました。 SS、CL、JL、MZ、AL が原子モデルを構築しました。 GH および AL は MsbA 配列を分析しました。 JL と AL は、他の著者からの意見を取り入れて原稿を書きました。

アルトゥール・ラガノフスキーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Antonio Calabrese 氏、Erik Yukl 氏、およびもう 1 人の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Lyu、J.、Liu、C.、Zhang、T. 他。 ABCトランスポーターMsbAの脂質および銅制御の構造基盤。 Nat Commun 13、7291 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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受信日: 2022 年 8 月 1 日

受理日: 2022 年 11 月 10 日

公開日: 2022 年 11 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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