きれいになった大動脈を通過: 3

Scientific Reports volume 12、記事番号: 8632 (2022) この記事を引用

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3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

大動脈壁の中膜は、エラスチンと平滑筋細胞（SMC）の層、および両層のコラーゲン線維が変化することを特徴としており、高血圧やアテローム性動脈硬化などの機能的および病理学的リモデリングにおいて中心的な役割を果たしています。動脈の機能は動脈壁の内部構造と密接に関連しているため、心臓血管の病態を理解するには、巨視的変形中の動脈の微細構造の変化を調査することが不可欠です。本研究では、ラット胸部大動脈の三次元機械的特性評価に組織除去法を採用し、組織の機械的完全性と柔軟性を維持しながら、管腔内加圧下での大動脈の3つの主要な構成要素のそれぞれの構造の変化を観察することに成功しました。弾性線維と SMC の層は、外膜側よりも内膜側で大きく変形しました。さらに、SMC核と弾性線維の内膜側では整列角度に構造的一致があったが、外膜側では一致しなかった。これは、大動脈の 3 つの主要な構成要素の微細構造の変化が視覚化され、大動脈を通して評価された最初の研究です。ここで確立された方法は、他の荷重に耐える軟組織の組織力学を理解するのにも役立ちます。

大動脈壁は、内膜、中膜、外膜の 3 つの層によって特徴付けられます。その中で、媒体は主に大動脈の機械的挙動を支配し、高血圧やアテローム性動脈硬化などの機能的および病理学的リモデリングにおいて中心的な役割を果たします。培地は主にエラスチン、コラーゲン、血管平滑筋細胞（SMC）で構成されており、それぞれが異なる次数の弾性率を持っています。つまり、エラスチン、コラーゲン、SMC の弾性率の一般に受け入れられている値は、それぞれ約 0.6 MPa1、1 GPa1、1 ～ 100 kPa2 であると報告されています。エラスチンと SMC は、中膜に弾性層（EL）と平滑筋層（SML）という明確な交互層を形成します 3。一方、コラーゲン線維は中膜と外膜の両方の層に存在します。弾性ラメラは、円周方向に配向したエラスチン (内側エラスチン全体の 71%) で構成され、シート状 EL 構造内に小さな窓を持ち 4、5、6、無負荷状態では円周方向と軸方向の両方に波状の構造を示します 7。 8、9。この構造的不均一性により、管腔内加圧下の大動脈の非線形で粘弾性の機械的挙動が生じました。

大動脈の機械的挙動は、一般に 2 つの段階で説明されます 10: 低圧範囲での大きな変形と、高圧範囲での小さな変形です。低圧領域の第 1 段階では、弾性線維の周方向の伸張と波状コラーゲン線維の真っ直ぐ化によって大動脈壁が放射状に拡張します。一方、高圧領域の第 2 段階では、生理的血液の範囲内およびそれ以上に相当します。圧力がかかると、硬くてまっすぐなコラーゲン線維が機械的ストレスに耐えるため、大動脈壁は限られた拡張を示します11。組織の変形中、SMC も主に円周方向に変形します 12。これが SMC 機能の機械的なトリガーである可能性があります。動脈の機能は動脈壁の内部構造と密接に関連しているため、心血管の病理とそれに伴う動脈の機能と力学の変化を理解するには、巨視的変形中の動脈の微細構造の変化を調査することが不可欠です。このような情報は、独特の三次元動脈構造を保存する実験から得る必要があります。

無傷の大動脈外植片を使用した大動脈の機械的挙動の三次元特性評価の最近の試みでは、波形を保ったままのコラーゲン線維の割合が、高圧範囲であっても SML よりも EL の方が高いことが実証されており、これは、SML が動脈硬化中に EL よりも引き伸ばされることを示唆しています。加圧。これにより、円周方向の変形中に層間滑りが発生する可能性があります14。一方、この研究では、ELとSMLのひずみレベルは同様のレベルであり、ELおよびSMLの内層から外層までのひずみレベルには統計的に有意な差がなかったとも報告されています。これらの所見は、マウスの胸部大動脈から得られたものであり、これはおそらく、大型動物の厚い大動脈標本を通る励起二光子レーザーの透過率が限られているためである 13,15 。したがって、血管の生体力学を包括的に理解するには、管腔内加圧下のさまざまなモデル動物の大動脈の三次元の力学的挙動を研究する必要があり、これを達成するには、適切な実験設定を確立する必要があります。

光学顕微鏡は、血管を含む生体軟組織の機械的挙動を特徴付けるための強力なツールです。しかし、従来の共焦点レーザー顕微鏡や多光子顕微鏡では、生体組織の光の散乱や吸収が大きいため観察できる深さに限界があり（最大数十～200マイクロメートル）、立体的な観察が困難でした。組織の深部の調査は困難を極めました。このような困難を克服するために、光学的除去方法が提案されている16。これらの技術は組織外植片全体またはマウス全体の観察に役立ちますが 17、これには組織の固定と特定の組織成分（脂質など）の除去が含まれ、組織サンプルが固化するため、組織の観察には適していませんでした。機械的負荷による軟組織の変形18、19。最近、胚全体、オルガノイド、さらには小モデル動物の生存能力を透明化しながら維持できる、新しい透明化方法が報告されました20。実際、我々の以前の研究では、この方法により腱組織の除去に成功しました21。本研究では、ラット胸部大動脈の三次元機械的特性評価にこのクリアリング方法を採用し、組織の機械的完全性の維持を証明しながら、管腔内加圧下での大動脈の3つの主要な構成要素のそれぞれの構造の変化を観察することに成功しました。そして柔軟性。ここで確立された方法は、大型動物の血管だけでなく、他の種類の負荷に耐える軟組織の 3 次元機械的特性評価にも適しています。

まず、二光子顕微鏡を使用して、組織の除去によって大動脈標本の視認性がどのように向上するかを確認しました。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中で正常で浄化されていない状態の大動脈では、外膜表面の最上部から約 60 μm の組織深さに相当する最外側の EL の画像しか取得できませんでした (図.1a)。対照的に、PBS (透明溶液) 中の 60% イオジキサノール溶液 (Optiprep、Abbott Diagnostics Technologies AS、米国) を使用した光学的透明化の後、大動脈壁から外膜から約 90 µm の深さに存在する内膜までを観察することに成功しました。外膜表面 (図 1a)。培地中の SMC 核からの弱い蛍光シグナルは、これらの SMC が染色期間中まだ生存していたと考えられることに起因することに注意してください。

(a) 組織除去法による視認性の向上。ラット胸部大動脈の短い部分を分離して背側を切り開き、腹部側を二光子顕微鏡で外膜から内膜に向かって、PBS中で正常な非透明状態で観察した（左）。透明化溶液中で透明化された状態の同じ標本（右）。提示された画像は、元々軸周面で得られた画像からの半径周面 (r − θ) 面への投影画像でした。エラスチン自己蛍光 (緑色)、コラーゲン SHG (青色)、および平滑筋細胞核からの蛍光シグナル (赤色) が統合されました。バー = 50 μm。 (b) 光学的透明化後のラット胸部大動脈の微細構造の保存。 r − θ 平面の断面画像は、正常な浄化されていない大動脈 (左) と浄化後の同じ大動脈 (右) から得られました。バー = 50 μm。全体の画像 (上) は、エラスチン自己蛍光 (緑色)、コラーゲン SHG (シアン)、および平滑筋細胞核からの蛍光シグナル (赤色) を合成した画像です。各コンポーネントの微細構造も個別に表示されます。これらは、各全体画像内の白い破線で示された長方形の領域の拡大画像です。矢印は、正常な大動脈ときれいな大動脈の両方で観察された各コンポーネントの代表的な微細構造を示しています。バー = 50 μm。

また、本発明の光学的除去方法が大動脈壁に何らかの構造的変化をもたらしたかどうかも調べた。エラスチン線維、コラーゲン線維、平滑筋細胞の微細構造が、きれいになった大動脈内で良好に維持されていることが明らかでした（図1b）。また、除去された状態では、除去されていない状態と比較して、波状の弾性薄板が比較的真っ直ぐになり、平滑筋細胞核が狭くて長くなったことが観察され、おそらく除去された大動脈の外径が増加した可能性があります。この証拠は、同じクリアリング方法で生物体および細胞を保存するという以前の発見とよく一致しており、現在のクリアリング技術では顕著な構造変化が生じていないことが証明された。

次に、組織除去方法が大動脈の機械的挙動を変えるかどうかを、図2aに示すセットアップを使用した圧力直径テストで調べました。検査中の透明溶液中では、大動脈が透明になりました (図 3)。これは可逆的な変化でした。除去された大動脈の不透明度は、0.18 ± 0.13 (平均 ± SD、N = 3) であると決定されました (分析については補足図 S1 を参照)。 PBS で試験した正常な非透明大動脈標本と、透明溶液で試験した透明大動脈標本との間に、変形挙動に明らかな差異はありませんでした (図 4)。検査した管腔内圧の範囲全体にわたって、きれいな状態の大動脈の直径が正常な状態の大動脈の直径よりも相対的に大きいという一般的な傾向があった。ただし、直径の非線形変化は両方の条件で一貫していました。大動脈は、40 mmHg 未満の圧力では変形能が低く、40 ～ 80 mmHg の間では直径が着実に増加し、100 mmHg を超えると直径はほとんど変化しませんでした (図 4)。 2 つの実験では、透明溶液での試験後、標本を PBS に戻し、4 °C で保存し、翌日に同じ試験プロトコルを繰り返しました。 2日目のPBSと透明化溶液の両方の圧力と直径の関係は、初日に得られたものと同様であり（補足図S2）、組織透明化プロセスにもかかわらず組織構造が保存されていることを示しています。

(a) 圧力直径テストと (b) 動的二光子顕微鏡検査の実験セットアップの概略図。

圧力直径試験を受けたラット胸部大動脈標本の代表的な写真。 (a) 試験片は PBS でテストされ、(b) その後、試験片は透明化され、透明化溶液中でテストされました。肋間動脈を閉じるために作られた背側（裏側）の黒い結び目は、除去された大動脈を通してはっきりと見えるのに対し、正常な除去されていない状態では見えないことに注意してください。

PBS中の正常な状態および透明化溶液中の透明な状態で試験されたラット胸部大動脈の圧力と直径の関係。

管腔内圧力の印加下で大動脈壁を通る組織構造の変形を観察するために、大動脈標本を取り出し、図2bに示す装置を使用して動的多光子顕微鏡検査を行いました。信号強度プロファイルで実証されているように、多光子顕微鏡を使用して、除去された大動脈内の弾性線維と SMC 核の三次元分布が明確に得られました (図 5、6)。エラスチンおよび平滑筋細胞核と比較してシグナル強度が弱いにもかかわらず、コラーゲン線維も大動脈壁の厚さ全体に観察されました。図 6 は、EL と SML のそれぞれにおける弾性線維の微細構造、SMC 核の分布、およびコラーゲン線維を示しています。深さ系列画像全体にわたる各成分の配向角度分布のピークと変動性も図 5 にプロットしました。弾性線維、SMC 核、コラーゲン線維はすべて同様の角度分布プロファイルに従いました。これらのコンポーネントの大部分は 90° (円周方向) に整列され、一部の層は円周方向 (約 30°) からわずかにオフセットして整列されました。管腔内圧力を加えると配向角分布のばらつきが小さくなった。実際、ELとSMLの両方で、全体の配列のピーク角度は0から130 mmHgまで一貫して約90°であり、圧力レベルの増加とともに変動は減少しました（補足図S3）。 ELとSMLの両方の圧力の増加に伴って分散も減少しました（補足図S3）。

エラスチン自己蛍光、SMC 核染色、およびコラーゲン SHG の代表的なシグナル強度プロファイル (上)、および (a) 0 mmHg および (b) 70 mmHg の管腔内圧力で透明な大動脈を通して得られた各成分のピーク配列角度 (下) mmHg。シグナル強度は、それぞれの成分の最大強度に正規化されました。ピーク配向角度 (下部の実線でプロット) および角度分散 (標準偏差に相当、バンドとして表示) は、ImageJ/Fiji の Directionality 関数を使用して決定されました。横軸のゼロ点は最初のEL(EL1)のピークに相当する。垂直に描かれた灰色の破線と実線は、それぞれエラスチン自己蛍光と SMC 核蛍光の局所ピークの深さ位置を示します。 90°のピーク角度は大動脈の周方向に対応します。

除去された大動脈で視覚化された EL、SML、および EL と SML の両方のコラーゲン線維の微細構造を層ごとに表示します。 r軸、θ軸、z軸はそれぞれ径方向、円周方向、軸方向を示します。 θ − z 平面上の EL、コラーゲン、および SML の深さスタックからの単一スライスが中央に表示され、個々の層の微細構造が示されています。 r − θ 平面上の EL と SML の画像（それぞれ左と右）は、θ − z 平面上の画像スタックを r − θ 平面に投影することによって作成されました（それぞれ EL のスライスと SML の標準偏差）。

また、平滑筋細胞核の配列がエラスチン層の内側（内膜側）または外側（外膜側）の弾性線維の配列と一致するかどうかも解析しました（図7）。 40 mmHgの管腔内圧力では、SMC核の配列は内層の弾性線維の配列とほぼ一致しましたが、外層のエラスチンの配列とは一致しませんでした（図7a）。実際、回帰係数は、SML と外側 EL の間の関係よりも、SML と内側 EL の間の関係の方が有意に高かった (P < 0.001)。 100 mmHg では、傾向は 40 mmHg で観察された傾向と同様でした (図 7b)。 40 mmHg での関係と比較して、弾性線維と SMC 核の両方でピーク角度の範囲が小さくなりました。 SMC 核の整列は、内側 EL の弾性線維の整列とよく一致しましたが、外側 EL の弾性線維の整列との相関は低かった。また、回帰係数は、SML と外側 EL の関係よりも、SML と内側 EL の関係の方が有意に高いことが確認されました (P = 0.020)。

ELピーク角度とSMLピーク角度の相関分析。相関関係は、SML とその内部 EL (左) の間、および SML とその外部 EL (右) の間で計算されました。角度は、それぞれ (a) 40 mmHg および (b) 100 mmHg の圧力レベルで得られました。 90°のピーク角度は大動脈の周方向に対応します。 N、標本数。 n、分析された SML 層と EL 層のペアの総数。 nについて統計分析を実行しました。

きれいになった大動脈を加圧すると、内層の弾性線維とSMLが外層よりも周方向に大きく変形する明らかな傾向が見られました（図8）。最も内側の EL (EL1) の周方向ひずみのレベルは、調べたすべての圧力レベルで最も外側の EL (EL6) よりも有意に大きかった (P = 40 mmHg で 0.0006、70 mmHg で 0.0009、100 mmHg で 0.01、および 100 mmHg で 0.01)。 130mmHg）。 EL1 のひずみレベルも、それぞれ 40 mmHg で EL 3 (P = 0.01)、40 および 70 mmHg で EL5 (40 mmHg で P = 0.004、70 mmHg で 0.01) よりも有意に高かった。最も内側の SML (SML1) は、それぞれ 40 mmHg で SML4 (P = 0.039)、40 および 70 mmHg で SML5 (40 mmHg で P = 0.007、70 mmHg で 0.044) よりも有意に大きい周方向ひずみレベルを示しました。 SML2 のレベルも 40 mmHg で SML5 より有意に高かった (P = 0.023)。内側の SML のひずみレベルも、より高い圧力レベルでは外側の SML のひずみレベルよりも大きくなりましたが、層間の差は統計的に有意ではありませんでした。

動的二光子顕微鏡法から得られた、(a) EL および (b) SML の各層の加圧中の円周方向 (左) および軸方向 (右) のひずみ。 EL周方向ひずみのプロットにおけるPDは、圧力-直径試験結果における見かけの直径の変化から単純に計算された周方向ひずみを示します。 N、標本の数。統計解析は、丸括弧内に示されたひずみデータに対して実行されました。

対照的に、EL および SML の軸方向のひずみレベルにはそのような明確な傾向はありませんでした。 EL と SML の両方において、外層のひずみレベルは内層よりわずかに高かったものの、軸方向のひずみの大きさは円周方向のひずみの大きさよりも著しく低かった。調べたどの圧力レベルでも層間に統計的に有意な差はありませんでした。

コラーゲン層 (CL) のひずみは、大動脈壁の厚さ全体にわたってコラーゲン SHG 画像が明確に得られた唯一のサンプルであるため、1 つの標本のすべての圧力レベルで分析されました。 EL のコラーゲン線維 (CL(EL)) と SML のコラーゲン線維 (CL(SML)) のひずみを、EL ひずみ解析と同じ方法を使用して別々に解析しました。内層の周方向ひずみが外層の周方向ひずみよりも大きいという一般的な傾向があり（補足図S4）、ELおよびSMLのひずみで観察された傾向と一致しました。

本研究では、ラット胸部大動脈をその機械的コンプライアンスを維持しながらその深部まで光学的に除去し、管腔内加圧下の三次元組織挙動を特徴付けた。特に、大動脈の 3 つの構成要素、つまりエラスチン、平滑筋細胞、コラーゲンの各層の機械的ひずみを個別に測定したところ、外膜側と比較して内膜側の弾性ラメラの変形が著しく大きいことが明らかになりました。著者らの知る限り、これは、大動脈の円筒構造を維持しながら、加圧に応じた大動脈の 3 つの主要な構成要素の微細構造の変化を評価した最初の研究です。

文献には、マウスモデルを使用した、光学的透明化を行わない動脈壁を通した観察に関する報告がいくつかある 22,23。しかし、ラットの胸部大動脈の場合、おそらくラットでは壁が厚いため、光学的透明化なしでは壁を通して見るのは困難でした（図1a）。本研究では、クリアリング法により、屈折率の不一致を解決することで大動脈全体の線維や細胞核の微細構造を観察し、画像からひずみを計算することができました。したがって、光学的透明化により、より厚い動脈の壁を通して観察し、詳細な顕微鏡画像を取得することが可能になります。現在の技術は、マウスの胸部大動脈よりも大きな血管の機械的挙動の詳細を研究する機会を提供します。

大動脈の直径は、透明化溶液中でインキュベートした場合にわずかに増加しました（図 4）。これは、透明化溶液による組織脱水の影響によるものと考えられます。ただし、6時間にわたって、透明溶液に近い浸透圧の溶液であっても、高張食塩水中でインキュベートした大動脈の直径の統計的に有意な変化は確認されませんでした（補足図S5）。したがって、この直径のわずかな増加は組織の脱水だけが原因ではない可能性があります。しかし、浄化されていない大動脈と比較して、浄化された大動脈ではELがわずかに真っ直ぐになり、SMC核が狭くなり、長くなったことが明らかでした（図1b）。したがって、浄化液の溶質であるイオジキサノールの物理化学的性質は、大動脈の構造に影響を与え、大動脈をわずかに膨張させる可能性がありますが、本研究の実験結果と結論には重大な影響はありません。

本研究の重要な発見の 1 つは、除去された大動脈の組織変形性が、除去されていない元の大動脈の組織変形性と類似していたということです。両方の状態の大動脈は、非線形の圧力と直径の関係を示しました (図 4)。管腔内加圧下のこのような機械的挙動は、同じ動物モデルの同じ動脈を使用した以前の研究 24 や、他の種の同じ動脈および他の動脈を使用した以前の研究でも報告されています 25、26。他の研究との一致は、本研究で得られた機械的データだけでなく、動的二光子顕微鏡実験における現在の光学的透明化法の使用も検証します。

管腔内圧力下での大動脈の挙動の特性評価は、二光子顕微鏡法 13、14、22、23、27 および X 線シンクロトロン 28 を使用した以前の研究で試みられています。しかし、得られた知見は、圧力下での外膜コラーゲン線維の配向角の変化27、ELおよびSMLにおける内側コラーゲン線維の配向角の変化、および矯正の程度の違いなど、選択された組織構成要素の機械的挙動に限定されていました。 EL と SML の間のコラーゲン線維の変化 13、EL と SML の間のせん断ひずみ 14、圧力下での波形の弾性ラメラの展開 28。本研究は、3 つの大動脈構成要素すべての配置と変形が最も内側の弾性ラメラから最も外側の弾性ラメラまで分析されたという点で、これらの研究とは異なります。それにもかかわらず、コラーゲンSHGシグナルの強度はサンプル間で異なり、特に内膜側のELおよびSML（本研究ではEL1〜3）のコラーゲン線維からのものであったことに注意する必要があります。この考えられる理由は、外膜のコラーゲン線維による SHG シグナルの吸収でした。インビトロ実験設定で生体内組織の機械的挙動を再現するために大動脈の元の組織構造を保存するために必要であるため、外膜を所定の位置に保持しました。しかし、外膜コラーゲン線維がコラーゲン SHG シグナルを吸収し、シグナルが検出器に到達するのを妨げた可能性が非常に高かった。エラスチンの自家蛍光や細胞核からの蛍光が大動脈壁の奥深くまで観察されることに成功したため、二光子励起レーザー光は外膜コラーゲン線維に吸収・散乱されませんでした。

内膜側の層が外膜側の層よりも大きく変形していることが明確に示された（図８）。ラットの高血圧に対する大動脈壁のリモデリングを評価した以前の研究では、内膜側の SMC が外膜側の SMC に比べて大幅に肥大化しました 29。内膜側のEL（特にEL1）は外膜側のEL（特にEL6）よりも周方向に著しく大きくひずんでいるという我々の結果、およびSMLで観察された同様の傾向は以前の知見とよく関連しています。今回の証拠は、大動脈内の高血圧が内膜側のSMCに大量の機械的歪み（円周方向）を加え、細胞が構造的に適応することで増加した歪み（および関連するストレス）に応答するという現在の概念を裏付けるものである。周囲応力を生理学的レベルに維持します。

層間のひずみの大きさの違いに加えて、構成要素間のひずみの大きさの違い、および配向角度の変化も評価されました。ただし、各層の 3 つのコンポーネント間のひずみの大きさに統計的に有意な差は見つかりませんでした (補足図 S6)。また、膨張中の配向角度の有意な変化 (補足図 S7) も見つかりませんでした。さらに、コンポーネント間の相互作用の詳細な調査が試みられましたが、現在の画像解像度では実行が困難でした。 SMC の細胞体と隣接するコラーゲン線維の間の摩擦せん断刺激は、コラーゲン線維と SMC の間の局所的なひずみの大きさが異なるために発生する可能性があるため、SMC がその場でどのように刺激されるかのメカニズムを視覚化できる可能性があるという仮説が立てられています。 SMC の機械環境のこのような詳細は、今後の研究の目標となります。

ひずみデータ (図 8) では、圧力直径試験 (PD) の直径変化から計算された円周方向ひずみが、動的二光子顕微鏡 (EL1 ～ EL6) から計算されたものよりも小さいことが明らかでした。これは、内圧がかかった厚肉シリンダー内の半径方向に沿った円周ひずみの理論的な壁内分布に従います。つまり、大動脈の外側の画像から大動脈径を計測しているため（図3）、EL6よりも外側で歪みの計測が行われ、EL6よりも歪みの値が小さくなりました。さらに、局所的な EL 歪みが大動脈の腹側で測定されたことを強調しておく必要があります。私たちの以前の研究 30 および他の研究 31 では、管腔内の加圧に応じた大動脈の周方向の伸びは、背側よりも腹側で大きかった。本研究における PD 歪みに相当する大動脈の全周方向の伸びが腹側と背側の歪みの平均として推定できることを考えると、腹部の周方向の歪みは全周方向の歪みよりも約 5% 大きかった 30,31。本研究では、EL6 の周方向ひずみは PD の周方向ひずみより 7 ～ 10% 大きく、これはこれらの以前の結果と基本的に一致しました。 EL6 ひずみは大動脈の内側で測定されたのに対し、PD ひずみは大動脈の半径方向最表面から測定されたため、EL6 ひずみは大動脈の腹側の最表面で測定された周方向ひずみよりも大きい可能性があります。ひずみ測定における半径方向の位置のこの違いは、EL6 ひずみと PD ひずみの間の差が、報告されている腹側伸張比と全周方向伸長比の間の差よりも相対的に大きいという結果につながった可能性があります。また、PD と EL6 の違いには、ひずみ測定方法（EL6 では繊維構造から測定されるのに対し、EL6 では動脈全体のサイズから測定される）や画像化方法（二光子顕微鏡と実体顕微鏡）の違いなど、いくつかの要因が影響します。

本研究におけるもう 1 つの重要な発見は、SMC の核とその下の弾性線維の整列角度が一致していることです。 SMC は内側と外側の両方で EL に固定されると報告されています 4,32 が、EL の片側への核の整列の優先性は、大動脈壁の構造発達プロセスに関連している可能性があります。大動脈構造は、内皮細胞による管状構造の形成に続いて、間葉細胞によって包み込まれることによって形成されると考えられています33。細胞が SMC に分化すると、エラスチンが合成され、細胞の層の間に沈着します 33。内膜（内側）側は腔内圧によって外膜（外側）側よりも大きく変形するため、細胞は機械的ひずみに耐えるために、変形の方向に整列した繊維で強化された構造を内側に構築することを好む可能性があります。各層に高度に組織化されたコラーゲン線維を含む三次元層状構造は、分子密集を介してコラーゲン分子自体でのみ形成できるため、弾性線維の整列構造の自発的形成など、他のメカニズムも可能である可能性があります34。しかし、大動脈の発達においては、間葉細胞がエラスチン合成の前に蓄積するため、これは当てはまらない可能性があり、弾性線維の自発的な整列形成のための時間や空間がない可能性があります。

動的二光子顕微鏡法では、死細胞核を標識するエチジウムホモダイマー-III で細胞核を蛍光標識しました。この色素は、標本からの発光波長の分離と染色性に基づいて選択されました。しかし、死細胞マーカーによる良好な染色性は、除去された大動脈内の SMC が生存していないことを示しています。収縮と弛緩の間の SMC 状態が筋性動脈の機械的挙動に大きな影響を与えることはよく知られていますが、頸動脈などの弾性動脈の挙動にはわずかな変化しか観察されませんでした 35。本研究で使用されるラット大動脈も弾性動脈として分類されます。したがって、SMC は除去された大動脈では生存できませんが、除去された大動脈の機械的挙動は、正常な除去されていない大動脈の挙動をよく表すと考えられます。

組織除去技術が組織力学に影響を与えることが報告されています 36。この報告では、80% プロピレングリコール (PG) を添加した PBS をブタ大動脈の光学的透明化に使用し、組織を脱水して光学的透明性を獲得しました。この技術により、大動脈の硬さも増加しました。 PG による組織の透明化は、組織からの光散乱水の除去と、透明化溶液 (つまり PG) 中の化学物質による高次コラーゲン構造の不安定化によって達成されるため 37、機械的挙動の変化は避けられません。一方、本研究では、PBS 中の 60% イオジキサノール溶液 (Optiprep) を透明溶液として使用しました。この溶液の推定浸透圧は 470 mOsm/L です。これは、PBS 中の 80% PG の推定重量オスモル濃度 (11,000 mOsm/L) よりも著しく低かった 38。培地への Optiprep の添加は、イメージング中の組織/細胞とイメージング用の培地間の屈折率の不一致を軽減することを目的としています 20 が、組織の透明性を得るために組織の脱水を誘発することは目的ではありません。実際、ブタ大動脈は、30% PG 溶液 36 (4000 mOsm/L と推定される 38) 中でインキュベートした場合、不透明のままであることが実証されました。したがって、我々の透明化溶液による浸透圧による脱水は非常に小さく、ラットの大動脈を透明にするのに十分ではないと考えられます。また、除去されたラット大動脈の機械的挙動が正常な大動脈の挙動と類似していることも我々の結果に反映されており（図４）、おそらく現在の除去方法が組織力学に及ぼす影響が小さいことを示唆している。組織脱水戦略は、ブタ大動脈のような厚い標本を光学的に除去するのに適切である可能性があり、したがって、大きな大動脈標本の組織除去方法を比較することは、将来の研究で興味深い研究テーマとなるでしょう。

本研究の限界の 1 つは、組織の除去が大動脈の機械的反応、特に微細構造レベルで影響を与えるかどうかを調べていないことです。組織の除去により、負荷のない状態の大動脈の構造（図 1）および巨視的な機械的挙動（図 4）に顕著な変化が生じないことは確認されましたが、これらの発見は、微細構造の反応も同様であるという確証を提供しません。正常な大動脈と除去された大動脈の間でも同様です。したがって、この問題に対処するために今後の研究が行われる必要がある。

結論として、我々は、組織のコンプライアンスを維持しながら、光学的クリアリングによる組織の厚さにわたる大動脈の機械的挙動の特性評価の実験モデルを確立した。弾性層の周方向のひずみの大きさは大動脈壁内の位置に強く依存しており、平滑筋細胞の向きはその内膜側に位置する弾性線維の向きとよく一致していることが確認された。

本研究では、合計 8 匹の雄の Wistar ラット (8 ～ 9 週齢) を使用しました。すべての動物実験は、名古屋大学大学院工学研究科動物実験審査委員会によって承認され（承認番号 18-8）、名古屋大学動物実験ガイドおよび ARRIVE ガイドラインに従って実施されました39。実験の数日前に一度に 1 匹の動物を購入し、屠殺するまで個別のケージに保管しました。全てのラットは、餌（CLEA Rodent Diet CE-2）と水を自由に摂取できるように、規則的な日内照明サイクル（12:12 明:暗）で維持されました。ケージ内を清潔に保つために自動フラッシングシステムが使用されました。動物は、年間を通して換気および 25 °C に維持された特別に指定された動物室に収容され、通常の日常活動が許可されました。屠殺前にラットには鎮痛は与えられなかった。動物の行動は毎日注意深くチェックされ、実験に使用する前にはすべての動物に明らかな異常は見られませんでした。実験は動物の使用を最小限に抑えるように設計されました。

動物を二酸化炭素ガスで屠殺し、屠殺直後に各ラットから生体内長約４０ｍｍの胸部大動脈の管状切片を採取した。近位切断位置と遠位切断位置との間の生体内長さは、以下に記載されるインビトロ実験における生理学的長さを再現するために記録された（平均伸張比１．４）。摘出した大動脈を PBS 中に置き、外膜を所定の位置に保ちながら、脂肪を含む大動脈表面の周囲の緩く結合した軟組織を慎重に除去しました。

孤立した大動脈から短い縦断面を採取し、背側を切り開いた。標本は、平滑筋細胞の核を染色するために、PBS 中の 5 μM エチジウムホモダイマー-III (Biotium、米国) 中で 4 °C で一晩インキュベートされ、二光子顕微鏡 (A1R MP、ニコン、日本) で画像化されました。 PBS 内ではクリアされていない通常の状態。長方形の標本を腹部側の外膜を上にして平らに置きました。軸周方向（z − θ）平面上の画像は、25 倍の水浸対物レンズと波長 860 nm の励起レーザーを使用して、外膜から内膜に向かって取得されました。エラスチンは、525/50 フィルターを使用した自己蛍光によって画像化されました。平滑筋細胞核からの蛍光シグナルは、575/25 フィルターセットを使用して取得されました。コラーゲン線維は、492SP フィルターセットを備えた光電子増倍管を使用してコラーゲン分子から第 2 高調波発生 (SHG) シグナルを収集することによって視覚化されました。それぞれが 510 μm 四方の領域をカバーする 512 × 512 ピクセルで構成される一連の深度画像を、エラスチンの線維構造が検出できなくなるまで、1 μm 間隔で 2 × 平均を行い、0.5 fps のレートで取得しました。次に、標本を透明化溶液中で透明化し、透明化溶液内で同じ方法で再度画像化した。得られた画像を径方向 - 円周方向 (r − θ) 平面 (標準偏差投影) に投影し、各条件での可視深度を実証しました。

軸長１ｍｍのリング状の標本を、別の単離したラット大動脈から、大動脈の長軸を横切る平面で切断することによって調製した。 PBS中の5μMエチジウムホモダイマー-III（ビオチウム）を用いて4℃で一晩標本中の平滑筋細胞核を蛍光標識した後、標本を透明ではない通常の状態で二光子顕微鏡（Nikon）下で画像化しました。 PBS内の状態。上述したエラスチン線維、平滑筋細胞、コラーゲン線維の全層を捉えた動径円周（r − θ）面上の画像。それぞれが 347 μm 四方の領域をカバーする 512 × 512 ピクセルで構成される一連の深度画像を、信号が検出できなくなるまで 0.5 μm 間隔で 2 × 平均を行い、0.5 fps のレートで取得しました。次に、標本を透明化溶液中で透明化し、透明化溶液内で同様の方法で再度画像化した。

組織除去の有無にかかわらず、大動脈の機械的挙動を特徴付けるために、3 匹の動物を使用して圧力直径テストを実行しました。大動脈標本の各端は特注のステンレス鋼の中空治具に取り付けられ、以前の研究で使用されたものと同様の検査装置（図2a）に接続されました13、14、腹部側を上に向けました（図3））。試験セクションの長さは少なくとも２０ｍｍであった。試験は、試料を PBS で満たされたデバイスの槽内に維持しながら、室温で実行されました。管腔内圧力はハンドポンプを使用して提供され、水銀圧力計 (Navis、日本) で監視されました。大動脈の画像は、実体顕微鏡 (M165 FC、ライカ) を備えた結合荷電素子 (CCD) カメラ (DFC310、ライカ、ドイツ) で撮影されました。標本を生体内の長さまで引き伸ばし、プレコンディショニングとして 0 ～ 200 mmHg の PBS による膨張と収縮を 10 サイクル適用しました。その後、インフレとデフレの単一サイクルが続きました。データ分析のために、膨張中は 20 mmHg の圧力増加ごとに、また収縮中は 20 mmHg 減少するごとに大動脈の画像が撮影されました。標本を試験装置から取り外し、大動脈が完全に除去されるまで、室温で２時間、除去溶液中に置いた。試験片を透明溶液中に保持して、試験プロトコルを再度実行しました (図 3)。一連の検査は大動脈の採取と同日に実施された。

別の 3 匹の動物を動的二光子顕微鏡法に使用しました。大動脈標本を上記のように収集し、ロッカー上で室温で1時間、PBSに5μMで溶解したエチジウムホモダイマー-III（ビオチウム）で細胞核を染色しました。次に、5 μM エチジウムホモダイマー-III を含む透明溶液中で、ロッカー上で 4 °C で一晩、標本を透明にしました。管腔内加圧中の大動脈の微細構造観察のため、二光子顕微鏡（Nikon）の電動ステージに取り付けられた圧力直径試験に使用したのと同じ試験装置に、腹部側を上に向けて標本を引き伸ばして取り付けました。生体内の長さ。このシステムは、多光子顕微鏡法用にわずかに変更されました (図 2b)。大動脈を透明溶液で満たされた槽内に保持し、飽和食塩水を満たしたリザーバー（25 mL シリンジ）の高さを変えることによって管腔内圧力を静水圧として加えた。リザーバー内の生理食塩水と標本内の浄化溶液は、フロー回路内に導入された単一の気泡を介して接続されました。圧力レベルは、リザーバーに接続されている端とは反対側の試験片の端に配置された圧力トランスデューサー (DX-100、日本光電、日本) で監視されました。

０から１６０ｍｍＨｇの間の管腔内圧力の適用による大動脈の膨張および収縮の１０サイクルが、プレコンディショニングとして実行された。続いて、標本に 0、40、70、100、および 130 mmHg を連続的に適用しました。顕微鏡画像は次のように各圧力段階で撮影されました。加圧中の大動脈の微細構造の変化を特徴付けるために、大動脈の 3 つの主要な構成要素、つまりエラスチン、平滑筋細胞、コラーゲンを、最も内側の内膜エラスチン層から最も外側の外膜コラーゲンまで、大動脈壁全体にわたって同時に画像化しました。層。合計最大 200 枚の画像で構成される深度シリーズが、0.67 または 1 μm の間隔でキャプチャされました。各画像は、347 μm 四方の領域をカバーする 512 × 512 ピクセルのサイズで、2 × 平均化により 0.5 fps のレートで取得されました。ハレーションを避けるために、各チャンネルのレーザー強度と光電子増倍管の感度が微調整されました。

得られた顕微鏡画像では、各弾性層の弾性線維の配列と各平滑筋層の平滑筋細胞核の変化が評価されました。 3 つの標本のうち 2 つは低いコラーゲン SHG 強度を示したため、コラーゲン線維整列解析は 1 つの標本でのみ実行できました。各圧力ステップでの各 EL および SML の代表的な領域を特定するために、EL および SML の深さ系列画像全体から 256 × 256 ピクセルの正方形領域が切り取られました。これにより、平均信号強度のプロファイルで最も特徴的な山と谷が得られました。深さ位置に沿った各画像スライスの(図5)。 EL の 6 つのピークと SML の 5 つのピークのそれぞれの深さ位置が特定され、対応する深さスライスが EL と SML のそれぞれの代表画像として選択され、その後の分析に使用されました。

弾性線維と平滑筋細胞核の配置は、ImageJ/Fiji (バージョン 2.1.0、NIH、米国) の Directionality 関数を使用して、深度シリーズ画像だけでなく、選択した EL および SML 画像でも評価されました。これにより、2 次元高速フーリエ変換 (2D-FFT) が実行され、ガウス分布の確率密度関数が画像内の弾性線維/核の角度分布にフィッティングされました。分析から、それらの方向性を記述する 3 つのパラメーターが得られました。それは、近似された確率分布関数のピーク (次数) と分散 (単位なし)、および適合度 (0 から 1 までの範囲の単位なしの値) です。 3つのパラメータのうち、弾性線維・細胞核の代表的な配列角度としてピーク値を使用しました。さらに、大動脈標本全体における EL と SML の全体的な平均ピークアラインメント角度の変化は、ピークの平均値と標準偏差、およびそれぞれ 2 つの標本からのすべての EL と SML の分散を単純に計算して比較することによって評価されました。圧力ステップ。

EL、SML、および EL および SML におけるコラーゲン線維ネットワークのそれぞれの変形を評価するために、画像ベースのひずみ解析が実行されました。各圧力ステップでの各コンポーネントのフルサイズの深さスタックから、各層の厚さ全体をカバーするサブスタック画像が収集されました。各層の深さ位置は、z − θ（軸円周）面の元の深さスタック画像から再構成された r − θ（半径円周）面画像の目視検査によって決定されました。各サブスタック内のすべての画像を合計して投影画像を作成し、合計 5 つの投影画像 (0、40、70、100、および 130 mmHg に対応) をスタックしました。

ひずみマーカーを設定するために、スタックシリーズ全体で追跡可能な各画像スタック内の特徴的なオブジェクトが、画像の水平中心線の周囲で手動で選択されました。 EL 画像では、これらの特徴は弾性繊維ネットワーク内の明るいスポットでした。これらは SML における典型的な細胞核でした。円周方向のひずみの場合、水平中心線を横切ってほぼ同じ水平位置に配置された 2 つのマーカーがペアになりました。ペアのマーカー間の距離を各圧力ステップで記録し、円周方向の公称ひずみを計算しました。各スタックのひずみ測定には、少なくとも 3 対のマーカーが使用されました。同様に、ほぼ同じ垂直位置に配置された 2 つのマーカーがペアになり、軸方向のひずみの決定に使用されました。

統計分析は統計言語 R (ver. 4.3.0) を使用して実行されました。 2つ以上のグループ間の比較は、クラスカル・ウォリス検定を使用して実行され、クラスカル・ウォリス検定で統計的有意性が見つかった場合は、続いてスティール・ドワス多重比較検定が実行されました。配向角分布の比較には、０ｍｍＨｇのデータを対照としてダネットテストを使用した。 2 つの独立した相関間の差異の有意性は、R パッケージ cocor40 を使用して評価され、フィッシャーの z 統計が計算されました。すべての検定で、有意水準は P < 0.05 に設定されました。

現在の研究中に生成および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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本研究の一部は、JSPS 科研費（No. 18K12028、15H05860、18H03752、19K22960）、JSPS 先端技術・研究資源基盤「先端バイオイメージング支援」（JP16H06280）、AMED-CREST 助成番号 JP19gm0810005 の支援を受けました。二光子顕微鏡 (A1RMP、Nikon) の使用については、名古屋大学大学院医学系研究科医工学研究部門に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました：前田英治郎と安藤頼子。

名古屋大学大学院工学研究科機械システム工学専攻バイオメカニクス研究室〒464-8603 愛知県名古屋市千種区不老町

Eijiro Maeda, Yoriko Ando, Kazuhiro Takeshita & Takeo Matsumoto

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EM は実験を実施し、データを分析し、原稿を作成しました。 YA は研究を概念化し、実験を計画して実施し、データを収集して分析しました。 KTは実験を実施し、データを収集しました。 TM は研究を概念化し、データを分析し、原稿を完成させました。 EM と YA はこの研究に等しく貢献しました。

松本剛夫氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

前田英治、安藤裕也、竹下和也、他除去された大動脈を通して: 光学的除去法を使用した管腔内加圧下でのラット胸部大動脈の機械的挙動の 3 次元特性評価。 Sci Rep 12、8632 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-12429-5

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受信日: 2021 年 12 月 9 日

受理日: 2022 年 5 月 9 日

公開日: 2022 年 5 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12429-5

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