ANGPTL7、眼圧上昇および緑内障の治療標的

Communications Biology volume 5、記事番号: 1051 (2022) この記事を引用

2800 アクセス

18 オルトメトリック

メトリクスの詳細

緑内障は失明の主な原因です。 現在の緑内障治療薬は、緑内障の危険因子である眼圧（IOP）を下げることによって機能しますが、ほとんどの治療法は、病気の進行に伴って薬剤耐性として現れる可能性があるIOPの増加につながる病理学的変化を直接標的にしていません。 IOPの生理学的調節因子を特定するために、IOP測定を行った129,000人以上の個人を対象にゲノムおよびエクソーム全体の関連分析を実施し、これらの発見を緑内障リスクの分析に拡張しました。 我々は、IOPの低下と緑内障の予防に関連するANGPTL7の稀なコーディングバリアント（機能喪失バリアントを含む）の同定と機能的特徴付けを報告します。 われわれは、Angptl7 ノックアウトマウスの基礎 IOP が野生型と比較して低く（約 2 mmHg）、ヘテロ接合体でも IOP が低くなる傾向があることを確立することで、マウスにおけるヒト遺伝学の知見を検証しました。 逆に、マウスの目に注射してマウスの Angptl7 レベルを増加させると、IOP が増加します。 また、成体マウスにおける急性の Angptl7 サイレンシングにより IOP が低下し (約 2 ～ 4 mmHg)、ノックアウト マウスでの観察が再現されることも示します。 まとめると、我々のデータは、ANGPTL7 が眼圧恒常性にとって重要であり、緑内障の発症を予防または進行を遅らせることができる健康な眼圧を維持するのに役立つ治療的調節を受けやすいことを示唆しています。

緑内障は不可逆的な失明の主な原因であり、40 ～ 80 歳の世界有病率は 3.54% であり、2040 年までに 1 億 1,180 万人以上が罹患すると予測されています 1。 神経変性疾患として分類される緑内障は、進行性の症状が特徴です。目の網膜神経節細胞の喪失と視神経乳頭の神経網膜縁の薄化。 影響を受けた人は、ほとんどの場合、眼圧（IOP）の上昇を伴う視野喪失を示します2。 原発開放隅角緑内障 (POAG) は最も一般的な緑内障のサブタイプであり、アフリカ系の人々の有病率が最も高くなります (アフリカでの有病率は 4.2%1)。

POAG のリスクが最も高い人は、60 歳以上、緑内障の家族歴がある、または強度の近視がある 3、4、5、6 です。 角膜中心厚（CCT）の低さ、カップ対ディスク比の増加、眼内圧（IOP）の高さなど、測定可能な眼の解剖学的および生理学的特徴は、緑内障のリスク増加と相関しており、緑内障8と同様に遺伝性が高い4、9、10。 11、12、13。 したがって、これらの定量的危険因子を多数の個人で測定すると、緑内障のリスクと進行の病因を解明するための遺伝的研究に強力なデータセットが提供されます。 IOP の最新のゲノムワイド関連研究 (GWAS) には 130,000 人を超える個人が含まれており、IOP 関連遺伝子座の数は 10014,15 を超えました。 以前の GWAS16 では、ゲノム全体の有意なレベルで IOP に関連する遺伝子座の約 89% が緑内障リスクに対して方向的に一貫した影響を示したことを報告しており、緑内障の遺伝子発見における定量的リスク因子の有用性が強化されています。

IOPは緑内障の発症または進行に対する唯一の修正可能な危険因子であり続けるため、IOPを下げることはすべての緑内障治療の中心です。 複数の薬剤クラスにわたって効果的な局所眼圧降下剤が多数利用可能ですが、それらには、頻繁な投与要件や副作用によるコンプライアンスの低下などの重要な欠点があります17。 時間の経過とともに効果が薄れ、その結果として治療の段階的拡大が必要になることも観察されています。これはおそらく、使用されている薬剤の大部分が、眼圧調節の主要な部位と眼からの房水の出口である線維柱帯（TM）の病態生理学的変化に対処していないためであると考えられます。 ）。 これらの制限により、緑内障治療計画の大部分は複数の治療薬で構成され、患者は頻繁に薬剤を変更したり、臨床的に許容可能なIOP18を維持するために最終的に侵襲的手術を伴う治療の段階的拡大を必要としたりすることになります。 したがって、緑内障の治療においては、安全性を損なうことなく耐久性と忍容性を向上させる可能性のある治療プラットフォームだけでなく、新規の作用機序を提供する新しい治療標的を特定するという、依然として満たされていない実質的なニーズが残っています。

われわれは、8つのコホートにわたってIOPと緑内障の遺伝関連解析を実施し、IOPを介して緑内障のリスクを調節する稀なコード変異体を特定した。 これは、別のグループによって最近報告された発見と一致して、ANGPTL7 が候補として同定されました 19。 この報告では、我々は、(1) 8つのコホートにわたってANGPTL7のGln175His変異体の一貫した保護効果を示し、(ii) 緑内障に関連するANGPTL7の超稀なミスセンス変異体の負担を特定することにより、緑内障予防との遺伝的関連を強化する。眼圧レベルの低下、および（iii）アフリカ系個体におけるさらに稀なANGPTL7機能喪失バリアントの同定。 また、(2) 遺伝子分析から特定されたANGPTL7変異体のインビトロ特性評価も提示する。 (3) Angptl7 を欠損するマウスでは基礎 IOP が低下し、低分子干渉 RNA (siRNA) による Angptl7 の部分的ノックダウンでもマウスの IOP の低下につながる可能性があることを示す in vivo の結果。 我々の結果は、ANGPTL7がIOPの生理学的調節因子としての重要な役割を確立しており、これが薬理学的ツールによる修飾にも適しており、緑内障治療の有力な標的となっていることが示唆されている。

私たちは、緑内障と診断された症例を除外したヨーロッパ系の129,207人を含む2つの大規模コホート、UK Biobank（UKB）とGeisinger DiscovEHR（GHS）全体で、まれなタンパク質を変化させる変動がIOPに及ぼす影響を研究しました（方法、補足表） 1)。 希少変異体との関連性を検出する能力を高めるために、各遺伝子のすべての希少（マイナー対立遺伝子頻度（MAF）< 1%）予測機能喪失（pLOF、ストップゲイン、フレームシフト、スプライスドナー、スプライスアクセプタ、スタートロス、ストップロス）およびミスセンス（5 つのアルゴリズム、補足メソッドによって有害と予測）のバリアント。 アンジオポエチン様 7（ANGPTL7）の変異と IOP 低下とのゲノムワイドな有意な関連（P < 5 × 10−8）が観察されました（ベタアレリック = –0.21 SD、 P = 5.3 × 10−24;図 1a）。 遺伝子負荷には 63 の稀な変異が含まれていましたが、ミスセンス (Gln175His、MAF = 0.7%) とストップゲイン (Arg177*、MAF = 0.03%) 変異の 2 つが大半を占め、全体のうち 1902 人と 82 人を占めました。それぞれ2188キャリアの（図1b、2、補足図1）。 UKB と GHS の間の負担メタ分析から Gln175His と Arg177* を除外しても、シグナルは完全には除去されませんでした (ベタアレリック = –0.23 SD、P = 4.4 × 10−4;補足図 2)。これは、他の超稀なバリアントが存在することを示唆しています。 ANGPTL7 の症状も IOP の低下と関連しています。

ヨーロッパ系の129,207人における、ANGPTL7の63のpLOFと有害な（5つの予測アルゴリズムに基づく）ミスセンス変異体のIOP低下との関連性。 b UKB 出身のヨーロッパ系個人における ANGPTL7 および IOP レベルのミスセンスおよび予測機能喪失 (pLOF) バリアント。 プロットは、5 つの異なるアルゴリズムによって有害と予測され、エクソーム配列決定された IOP 患者 101,678 人の中に少なくとも 5 人の保因者が存在する、ANGPTL7 の 1 pLOF および 10 のミスセンス変異を持つ保因者のゴールドマン相関 IOP (IOPg; 両眼の平均) レベルを表しています。英国バイオバンクでの測定結果。 49 個すべての pLOF および予測された有害なミスセンス ANGPTL7 変異体の保因者の IOP レベルの中央値 (14.64 mmHg) は赤線で示され、非変異保因者の IOP レベルの中央値 (15.46 mmHg) は青線で示されます。 マゼンタのひし形は、各バリアントの保因者の IOP 中央値を示します。 プロットの下には、IOP の中央値と四分位範囲 (IQR)、および緑内障と診断されたバリアントキャリアまたは UKB の対照の数が表示されます (n = 385,040)。 GHS Geisinger DiscovEHR、UKB UK Biobank、MAF マイナー対立遺伝子頻度。

ヨーロッパ系個人における、ANGPTL7 の Gln175His (a) および Arg177* (c) バリアントと IOP との関連、効果を標準偏差単位で測定。 b、d 英国バイオバンクの遺伝子型にわたる IOPg を表す箱ひげ図。 b Gln175Hisのヘテロ接合性およびホモ接合性保因者は、非保因者と比較して、IOPg中央値がそれぞれ0.8 mmHgおよび4.1 mmHg低い。 d Arg177* ヘテロ接合保因者は、非保因者と比較して IOPg が 1.4 mmHg 低い。 GHS Geisinger DiscovEHR、UKB UK Biobank、MAF マイナー対立遺伝子頻度。

単一バリアント解析では、Gln175His はゲノム全体の有意なレベルで IOP の低下と関連していました（ベタアレリック = –0.20 SD、P = 3.1 × 10−20、図 2a）。 ANGPTL7におけるGln175Hisのヘテロ接合性およびホモ接合性保因者は、UKBにおけるIOP中央値がそれぞれ5.2％（0.8mmHg）および26.5％（4.1mmHg）減少した（図2b）。 Arg177* バリアントも名目上、Gln175His と同様の効果量で IOP の低下と関連しており（ベタアレル = −0.24 SD、P = 2.6 × 10–2、図 2c）、77 人のヘテロ接合性 Arg177* キャリアは 9 % (1.4 mmHg) IOP 減少中央値 (図 2d)。 Arg177* は、ヨーロッパの人口において優勢な pLOF バリアントであると考えられます。 pLOF変異体（UKBおよびGHSにわたる15の変異体）に限定された負荷試験では、Arg177 *（合計112人の保因者のうち82人）が優勢であり、同等でした（ベータアレリック= –0.21 SD、P = 2.2×10−2;補足図3）。 Arg177* と IOP の単一変異型の関連性。

ANGPTL7 の追加の pLOF について他の祖先を検索し、ヨーロッパ人 (MAF = 0.0013%) と比較してアフリカ系の個人 (MAF = 0.3%) に豊富な Trp188* を特定しました。 われわれは、UKB および原発性開角アフリカ系アメリカ人緑内障遺伝学 (POAAGG) 研究のアフリカ系アメリカ人を対象に、Trp188* と IOP との関連性を調べ、続いてメタ分析を実施しました。 Trp188* は、Arg177* および Gln175His と同様に、IOP 低下の傾向を示しましたが、これは統計的に有意ではありませんでした (ベータアレリック = −0.11 SD、P = 5 × 10−1)。 Arg177 * および Trp188 * バリアントの交差祖先メタ分析では、IOP 低下と名目上有意な関連性が示されました（ベタアレリック = –0.21 SD、P = 1.5 × 10−2;補足図 4）。

要約すると、ANGPTL7 の Gln175His と IOP の低下との有意な関連性と、ANGPTL7 の pLOF 変異体との同じ方向で同様の大きさの閾値以下の関連性が観察されました。 pLOF 変異体が実際にタンパク質機能の喪失を引き起こすと仮定すると、我々のデータは、ANGPTL7 の喪失が IOP の低下につながる可能性があることを示唆しています。

ANGPTL7の変異保有者も緑内障から保護されるかどうかを理解するために、我々はUKB、GHS、およびニューヨーク州マウント・サイナイ・ヘルス・システムのマウント・サイナイのBioMe個別化医療コホートという6つの追加研究において、Gln175Hisと緑内障との関連分析を実施した。 SINAI）、スウェーデンのマルメのマルメ食とがんの研究（MALMO）、フィンランドのFinnGenコホート、エストニアのタルトゥ大学のエストニアバイオバンク（EstBB）、ノルウェーのノールトロンデラークのHUNT研究（HUNT）、デンマーク、コペンハーゲンのコペンハーゲン一般人口調査/コペンハーゲン市心臓調査（CGPS-CCHS）。 これら8つのコホートにわたるメタ分析では、Gln175Hisキャリアの緑内障リスクが大幅に減少することが示されました（オッズ比（ORアレリック）= 0.77、P = 2.7×10−6、図3a）。 また、より稀なArg177 * / Trp188 * バリアントのキャリアにおける緑内障リスクを祖先間メタ分析で分析し、リスク低下に向かう一貫した傾向を観察しました（ORallelic = 0.87、P = 4.1×10-1、図3b）。 。 まとめると、ANGPTL7 のミスセンス変異体と pLOF 変異体と IOP の低下との関連性、およびミスセンス変異体と緑内障リスクの低下との関連性は、ANGPTL7 の欠失が緑内障に対する防御をもたらし、この効果が IOP の調節を介して媒介されるという仮説を示唆しています。

a 8 つの異なるコホートにわたる緑内障を伴う Gln175His のメタ分析の結果。 b 5 つのヨーロッパ (EUR) および 3 つのアフリカ (AFR) 祖先コホートにわたる Arg177* および Trp188* の祖先間メタ分析。 EUR および AFR コホートのメタ分析における変異体は、それぞれ Arg177* および Trp188* でした。 GHS Geisinger DiscovEHR、UKB UK Biobank、SINAI Mt. Sinai Medical School BioMe Biobank、MALMO Malmö Diet and Cancer Study、EstBB タルトゥ大学のエストニア バイオバンク、HUNT ノル・トロンデラーグの HUNT 研究、CGPS-CCHS コペンハーゲン一般人口研究とコペンハーゲン市心臓研究、POAAGG 原発開放角アフリカ系アメリカ人緑内障遺伝学、MAF マイナー対立遺伝子頻度。

我々は、他の形質が pLOF の負荷および ANGPTL7 の有害なミスセンス変異と関連しているかどうかを理解するために、フェノムワイド関連解析 (PheWAS) を実行しました。 ANGPTL7 バリアント集合体を、UKB および GHS のそれぞれ 14,050 および 10,032 の二値形質および量的形質との関連についてテストしました。 GHS では、フェノム全体の有意性に達する関連性はありませんでした (合計 24,082 形質に対する複数検定補正後、P < 2 × 10–6)。 UKB における唯一の有意な関連性は、眼の特性 (表 1)、特に角膜補償 IOP (IOPcc) の低下、角膜抵抗因子 (CRF) の低下、および 3 mm および 6 mm で測定された弱経線と強経線の両方に沿った角膜屈折力の増加でした。直径。 これらのバリアントの IOPcc に対する効果は、IOPg に対する効果 (UKB では –0.23 SD) と比較してわずかに減衰しました (–0.17 SD)。これは、ANGPTL7 が、IOPg 測定に影響を与えることが知られている角膜特性に何らかの影響を与えていることを示唆しています20。 CRFの減少と観察された関連性は、ANGPTL7の角膜への影響とも一致しています。

直径 3 mm での自己屈折測定を使用して、臨床的に興味深い測定値、つまり平均角膜屈折力 (mCRP)、角膜乱視、および屈折乱視 (補足方法) を導き出し、ANGPTL7 との関連を確認しました。 mCRPの増加との有意な関連が観察されました（ベタアレリック = 0.16 SD、P = 1.1×10-13、表1）が、角膜または屈折乱視との関連は観察されませんでした。 また、mCRPの増加に起因する可能性のある平均球面等価物（MSE、屈折異常の尺度）または近視（MSEに由来するか、ICD-10診断によるもの）との関連性も観察されませんでした（補足表2）。 全体として、我々の PheWAS の結果は、ANGPTL7 が角膜の解剖学的構造/生体力学関連の定量的測定の変化と関連している一方で、我々がテストできた関連疾患の転帰のリスク増加は検出されなかったことを示しています。 さらに、ANGPTL7 の pLOF および有害なミスセンス変異体は、全身的な量的形質や二元的結果とは関連していません。

ANGPTL7 の発現および分泌に対する Gln175His、Arg177*、および Trp188* 変異体の影響を理解するために、HEK293 細胞でヒト野生型 (WT)、Gln175His、Arg177*、および Trp188* タンパク質を発現する構築物を一時的にトランスフェクトしました。 Taqman によって mRNA レベルを測定したところ、WT と比較して同様の Gln175His および Arg177* 転写レベルと、Trp188* 転写レベルの減少傾向が示されました（P = 0.08;補足図 5）。 しかし、ウェスタンブロッティングとELISAによる全細胞ライセート中の細胞内の定常状態タンパク質の分析により、WTと比較してGln175Hisレベルの増加が明らかになりました（P < 1×10-4;図4c）。 予想どおり、Arg177* および Trp188* は低分子量タンパク質 (約 30 ～ 32 kDa) をコードしていました。 WTと比較して、これら2つの変異体のタンパク質レベルに有意な差はELISAによって明らかにされなかった(図4a、c)。 ANGPTL7 は分泌タンパク質であるため、次に細胞上清中の WT、Gln175His、Arg177*、および Trp188* のレベルを測定しました。 ウェスタンブロットによるタンパク質分析により、Arg177 * および Trp188 * バリアントは検出できず、WT と比較して上清中の Gln175His が大幅に減少していることが示されました（P < 0.05;図 4b）。 ELISAアッセイは、Gln175Hisのレベルが大幅に低下していること、およびArg177*およびTrp188*が細胞外空間に到達できないことをさらに裏付けました（図4c、d）。

a、b ウェスタンブロッティングは、ANGPTL7 野生型 (WT)、Gln175His、Arg177*、および Trp188* の細胞内および細胞外タンパク質レベルを示します。 c ELISA を実行して、HEK293 細胞に一時的にトランスフェクトされた ANGPTL7 WT、Gln175His、Arg177*、および Trp188* の細胞内および細胞外タンパク質レベルを定量しました（全細胞溶解物は 1:1,000 に希釈し、上清は 1:10,000 に希釈しました。両方とも）全細胞ライセートと上清は、全細胞ライセートからのタンパク質の総量に対して正規化されました）。 ****= P < 1 × 10–4 WT 全細胞溶解物との統計的差異。 ^ = P < 0.05、^^^ = P < 1 × WT 上清との統計的差異。 d 分泌対細胞内ANGPTL7 WT、Gln175His、Arg177*、およびTrp188*タンパク質レベルの比。 生の ANGPTL7 WT、Gln175His、Arg177*、および Trp188* タンパク質レベルは、全ライセートタンパク質濃度に対して正規化されました。 **** = P < 1 × 10-4 WT との統計的差異。 ウエスタンブロッティングとELISA分析を3つの独立した生物学的複製に対して繰り返しました。 ELISA 分析のために技術的な反復 (n = 3) を実行しました。 P 値は、Tukey の事後分析を使用した一元配置分散分析によって計算されました。 すべてのデータは平均値として表示され、エラーバーは平均値の標準誤差 (SEM) を示します。 MWt 分子量マーカー。

さまざまな種の眼組織におけるANGPTL7の発現を特定するために、目のさまざまな部分からのトランスクリプトームプロファイルを生成しました（補足方法）。 ANGPTL7の高い発現が、ヒトおよびアフリカミドリザルの目の角膜、TM、および強膜で観察されました（図5a、b、補足図6）。 C57BL/6 J マウスの眼の角膜、TM、強膜、視神経乳頭、および脈絡膜/RPE でも Angptl7 の高い発現が観察されました (図 5c)。 ヒトANGPTL7およびマウスAngptl7用のRNAscopeプローブを使用したヒトドナーおよびマウスの目でのin situハイブリダイゼーションは、TM、角膜実質、および強膜におけるANGPTL7 / Angptl7発現を示しました（図5d、e;補足方法）。

RNA シーケンスに基づく発現レベル (100 万あたりの転写産物、TPM で測定され、中央値および四分位範囲として表される) は、ヒト (a) およびアフリカ ミドリザル (b) の角膜、小柱網 (TM)、および強膜で最も高くなります。 C57BL/6 J マウスの目、および角膜、TM、強膜、視神経乳頭、および脈絡膜 / RPE の C57BL/6 J マウスの目 (c)。 in situ ハイブリダイゼーション (RNAscope) は、ヒト (d) およびマウス (e) の眼の TM、角膜および強膜における ANGPTL7/Angptl7 (赤) の発現を示します。 スケールバーは 100 μm を表します。 DAPI 染色 (青) は細胞核を対比染色します。 RPE網膜色素上皮、CB毛様体、SCシュレム管、CM毛様体筋、AC前房、RGC網膜神経節細胞、INL内核層、ONL外核層。

これまでの研究では、TM 細胞における ANGPTL7 の過剰発現が細胞外マトリックス (ECM) の沈着と再構成の変化を引き起こすこと 21,22 と、緑内障患者の房水中で ANGPTL7 が増加することが示されています 22 が、IOP 調節における ANGPTL7 の役割は明らかではありません。 これを調査するために、硝子体内および前房内の経路を介してマウスに mAngptl7 タンパク質を注射し、経時的に IOP を測定しました。 マウス Angptl7 (mAngptl7) をマウスに硝子体内注射すると、最初に IOP が低下し、その後 4 日目から IOP が 4 ～ 5 mmHg 上昇し、ベースラインと比較して 22 ～ 25% 増加し、それが最後まで持続しました。 7日目の実験の様子（図6a）。 同様に、マウスにおける mAngptl7 の前房内注射は、3 日目から実験終了 7 日目まで、IOP の最初の低下とその後の上昇 (2 ～ 5 mmHg) を引き起こしました (図 6b)。 ビヒクルを注射したマウスは、どちらの投与経路でも IOP の増加を示さなかった。

マウス Angptl7 (mAngptl7) タンパク質を硝子体内 (a) または前房内経路 (b) 経由でマウスの目に注射し、IOP を経時的に測定しました。 最初の低下後、PBS 治療 (CTRL (PBS)) 眼と比較して、mAngptl7 治療眼では IOP が数日間上昇したままでした。 * = P < 0.05; ** = PBS 治療と比較した P < 0.01 統計的有意性。 統計分析は、Student の t 検定を使用して実行されました。

我々は、Angptl7-/- (KO) マウスを作成し、特徴付けました。 RNAscopeを介して、Angptl7 mRNAがKOマウスの眼組織では発現されていないのに対し、WTマウスのTM、角膜、および強膜では発現されていることを確認しました（図7;補足方法）。 さらに、目の組織学的分析では、WTと比較してKOマウスの眼角に差がないことが示されました（補足図7）。 前眼部光干渉断層撮影法では眼の変化や、2つの遺伝子型間の角膜厚さの違いは観察されませんでした（補足図8）。 また、KO、Angptl+/- (Het)、およびWTマウスのIOPをモニタリングし、3つの遺伝子型にわたって用量依存的なIOPの減少を観察しました(図8a)。 平均IOPは、WT（17.36±0.23mmHg）と比較して、KOマウス（平均値±平均値の標準誤差（SEM）：15.39±0.25mmHg）で11％（1.96mmHg、P<1×10-4）低下しました。 Het マウス (16.26 ± 0.43 mmHg) は、WT と比較して、小さい (6%、1.1 mmHg、P = 0.02) ものの有意な IOP 低下を示しました。

Angptl7 mRNA は、Angptl7 KO マウスの眼組織では発現されませんでしたが、in situ ハイブリダイゼーション (RNAscope) によって示されるように、WT マウスの TM、角膜、および強膜では発現されました。 以下のプローブを示す明視野画像。 ネガティブコントロール：DapB。 b ポジティブコントロール: Ubc (赤)。 c WT マウス: Angptl7 (赤色)、および (d) Angptl7 KO マウス: Angptl7 (シグナルなし)。 スケールバーは 100 μm を表します。

a IOPは、HetおよびWTマウスと比較してAngptl7 KOで有意に低下しました（平均±SEM; **** = P < 1×10–4）。 b KOマウスとWTマウス間の従来の流出設備（C）の比較。 KO マウス (n = 7) では、WT マウス (n = 4、P = 0.16、対応のないスチューデントの t 検定) と比較して C が増加しました。 データは平均値 ± SEM として表示されます。 c Angptl7-siRNA 15 μg の硝子体内注射は、PBS (n = 6) およびナイーブ (注射なし、n = 5) グループと比較して、テストした 6 つの siRNA のうち 2 つ (n = 6-8/グループ) で IOP を大幅に低下させ、維持されました。研究の終わりを通して低下しました。 siRNA 3 および 5 は、PBS 処置マウスと比較して、2 週目から IOP を 2 ～ 4 mmHg 低下させました。 * = P < 0.05、** = P < 0.01、*** = P < 1 × 10−3、**** = P < 1 × 10−4 siRNA #5 と PBS の平均 IOP 間の統計的差異# = P < 0.05、## = P < 0.01、### = P < 1 × 10−3、#### = P < 1 × 10−4 siRNA #3 と siRNA #3 の平均 IOP 間の統計的差異PBS処理。 d 顕微解剖した角輪輪からの qPCR の結果は、PBS 処理マウスと比較して、siRNA #3 および #5 による Angptl7 mRNA のノックダウン レベルが最も高かった (>50%) ことを示しました。これは、PBS を注射したマウスで観察された IOP 低下と非常に一致しています。これら 2 つの siRNA (b)。 データは平均値として表示され、誤差バーは SEM を表します。

Angptl7 は角膜と TM で高度に発現しており、Tonolab リバウンド眼圧計を使用して IOP を測定したため、角膜の Angptl7 機能が IOP に影響を与えていないことをさらに確認したいと考えました。 したがって、Angptl7 KO (n = 7) および WT マウス (n = 4) における IOP と流出抵抗の関係を理解するために、定流量注入を使用した従来の流出機能を測定しました。 従来の流出機能は、WTマウス（20.85 nL/分/mmHg）と比較してKO（25.18 nL/分/mmHg）で21％増加しました（P = 0.15;図8b）。 修正ゴールドマン方程式によれば、流出機能の平均増加は、KO における平均 IOP 低下と一致しました。

siRNA による Angptl7 のノックダウンも IOP を低下させることができるかどうかを調査するために、C57BL/6 J マウスで Angptl7 を標的とする 6 つの異なる siRNA (表 2) をテストし、IOP を経時的にモニタリングしました。 C57BL/6 J マウスに 15 μg の siRNA を硝子体内注射し、6 週間後に TM が豊富なマウスの眼から切除した輪部輪に対して qPCR を実行しました。 IOPは、PBS群およびナイーブ（注射なし）群と比較して、6つのsiRNAのうち2つ（siRNA #3および#5）で処置したマウスでは、注射後2週間で有意に低下した（図8c、補足データ1）。 ナイーブ動物と PBS 処置動物は、研究期間中 (0 ～ 6 週目) ベースラインの IOP を維持しました。 siRNA#3 および #5 で治療したマウスでは、PBS 治療マウスと比較して、IOP は 2 週目から 2 ～ 4 mmHg 低下しました (図 8c)。 研究の最後に、眼を収集し、角輪輪を注意深く顕微解剖し、qPCRを実行しました。 PBS処理マウスと比較して、siRNA #3および#5でAngptl7 mRNAの最高レベルのノックダウン（>50％）が観察されました（図8d）。これは、これら2つのsiRNAを注射したマウスで観察されたIOP低下と一致しています。 これらの結果は、Angptl7 発現の急性阻害も IOP を低下させることを示唆しています。

この研究では、眼圧の生理学的制御におけるANGPTL7の役割、および緑内障治療の潜在的な標的としてのANGPTL7の役割に関する遺伝的および機能的証拠を提示する。 谷川らによる最近の出版物 19 では、ANGPTL7 と緑内障との保護的関連性が特定されており、この論文では、(1) 谷川氏らが使用した UK Biobank および FinnGen の遺伝的関連分析に 6 つのコホートを追加することによって、この発見をさらに評価および強化します。ら、そしてこれらの大部分において、まれなミスセンス変異体である Gln175His (rs28991009) に対して一貫した保護傾向を示しています。 (2) ヨーロッパ人の Arg177* に加えて、ANGPTL7 においてアフリカ系の祖先が豊富な pLOF 変異体である Trp188* を同定し、両変異体が緑内障から保護される傾向にあることを示した (3) エクソーム配列決定と遺伝子負荷解析を通じて、複数の予測された有害な ANGPTL7 を同定これは、緑内障からの保護をもたらす非常にまれなANGPTL7変異体が他にも存在する可能性を示しています。 これらの新しい分析を総合すると、IOP 調節と緑内障の発症における ANGPTL7 の役割がさらに裏付けられます。 また、細胞ベースの発現アッセイを通じて、Gln175His、Arg177*、および Trp188* は野生型と比較して分泌に重大な欠陥があることも示しました。証拠ではありませんが、この観察は 3 つの変異体が原因で、タンパク質の機能が失われること。

ANGPTL7 は、ANGPTL ファミリーの他のメンバーと同様に、ホモオリゴマー (トリマーまたはテトラマー) を形成すると考えられている分泌糖タンパク質です 23,24。 ANGPTL7 mRNA は、他の組織と比較して最も高い発現を示すヒトの死後の目から最初に単離されました 23。 眼内では、我々の in situ ハイブリダイゼーションの結果は、以前の知見と一致して、ANGPTL7 が角膜と TM で最も強く発現していることを示しています 22。 我々はまた、単一細胞 RNAseq を使用して、ANGPTL7 発現が、IOP 調節と房水流出抵抗の生成に最も重要な TM の領域である小管近傍組織 (JCT) で特に豊富であることを示しました 25,26。 緑内障に直接関連する組織で発現されることに加えて、いくつかの証拠により、ANGPTL7 が緑内障の病態生理学に関与していることが示されている。 まず、緑内障患者の眼組織では、コントロールと比較して、前眼部外植片の灌流によってシミュレートされたIOP増加の条件下で、ANGPTL7 mRNAおよびタンパク質のレベルの上昇が観察されました22、27、28。 第二に、ANGPTL7 はコルチコステロイド治療に応答して最も上方制御される遺伝子の 1 つであり 29,30、一般人口の約 40%、POAG 患者の約 90% で IOP の上昇を引き起こす可能性があります 31,32。 第三に、ANGPTL7 レベルは、ECM を調節し、IOP33 の増加につながると考えられている成長因子である TGF-β に応答して増加します。 第 4 に、ANGPTL7 自体は TM ECM の構成要素の発現を調節することができます 21、22。

上記の研究は、ANGPTL7 発現と緑内障の病態との強い相関関係を示唆していますが、ANGPTL7 レベルと IOP/緑内障の上昇との因果関係の証拠ではありません。 ANGPTL7 欠損と IOP 低下との関連性がヒト遺伝学的に発見されたことは、ANGPTL7 が IOP 調節にとって生理学的に重要であることを示唆しています。 我々はこの仮説をマウスで検証し、相互実験を行った。つまり、マウスの目にmAngptl7を注射してANGPTL7レベルを上昇させた後、およびAngtpl7 KOマウスを作製してすべてのmAngptl7タンパク質を除去した後にIOPを測定した。 我々の調査結果は、mAngptl7の増加によりIOPの増加（〜2〜4 mmHg）がもたらされ、KOマウスによるmAngptl7の減少により基礎IOPレベルが低下（〜2 mmHg）することを示しています。 また、WT マウスと比較して KO マウスでは従来の流出機能が増加する傾向 (約 21%) も観察され、これは KO マウスにおける IOP の低下と一致していました。 まとめると、これらの発見は、ANGPTL7 が生体内で機能して IOP 恒常性を維持することを示唆しています。 さらに、Angptl7に対するsiRNAをWTマウスの目に注射することによってKOマウスで観察されたIOPの低下を再現しました。これは、遺伝子変異マウスでの観察を再現するだけでなく、IOPに対するmAngptl7の効果が発生後も継続し、調節を受けやすいことも示しています成人してからの治療法による。 Angptl7 KO マウスにおける IOP の低下という我々の結果は、ヒト遺伝学からの観察と非常に一致しています。 これに基づいて、siRNA ノックダウンの発見をヒトにも拡張し、成人期の ANGPTL7 阻害が IOP を低下させ、最終的には緑内障のリスクを低下させる効果的な戦略となる可能性があると推測できます。

私たちのヒト遺伝学の調査結果は、IOPの低下に関連するANGPTL7の変異は、角膜の弾性特性を反映する眼球反応分析装置の出力である平均角膜抵抗因子（CRF）の減少34、および平均角膜屈折力の増加にも関連していることを示しています（ mCRP）。 mCRP は、眼軸長およびレンズ度数とともに、眼の全体的な屈折状態に寄与しており 35、mCRP の増加（角膜の傾斜）は、近視または乱視の可能性を示している可能性があります。 しかし、PheWAS では近視や乱視との関連の証拠は観察されなかったため、mCRP の変化は疾患の転帰をもたらすには不十分であるか、あるいは眼軸長などの測定されなかった形質の他の変化によって補われるかのいずれかであると結論付けています。 。 角膜特性に対するANGPTL7の効果は、mCRPおよびCRFとの関連によって明らかに示されていますが、この効果は観察されたIOP低下の完全な程度を説明することはできないと主張します。 その代わりに、我々は以下のことに基づいて IOP 恒常性に対する ANGPTL7 の独立した寄与を仮定します: (1) IOPcc 低下との持続的な関連は、角膜特性を制御した後でも IOP 低下があることを示唆しています。 (2) Angptl7 KO マウスの目は、角膜菲薄化または他の角膜異常の証拠がなく、基礎 IOP の低下を示します。 (3) ANGPTL7 変異体と緑内障予防との関連は、IOP の低下が純粋に角膜解剖学的構造に対する ANGPTL7 の効果によるものである場合には予​​期しない結果です 37。 したがって、ANGPTL7 はヒトの IOP と角膜の解剖学的構造/生体力学の両方に多面的な影響を与える可能性が高いと考えられます。

開放隅角緑内障患者におけるANGPTL7の治療的ノックダウンは、新たな作用機序によってIOPを低下させるだけでなく、疾患の過程に介入するまたとない機会を提供する可能性がある。 最も広く使用されている眼圧降下剤の中で、TM レベルで発生する病態生理学的変化に直接対処するものはなく、その代わりに、房水の形成を抑制するか、代替手段を介して房水の流出を増加させることにより、従来の経路における房水の負担を軽減するメカニズムを通じて IOP を低下させます。ブドウ膜強膜）経路38。 したがって、緑内障患者のTM機能不全が進行するにつれて、当然のことながら治療も強化されます18。 TM の機能不全と IOP 上昇に寄与する経路における ANGPTL7 の役割を調査するにはさらなる研究が必要ですが、いくつかの証拠が TM のレベルでの線維化促進作用 (コルチコステロイドや TGF-ベータ反応性など) を示しています。 JCT TM ではその発現が強化されています (前述)。

すべての研究と同様に、この研究にも限界があります。 まず、IOP 分析では IOP を低下させる薬剤の使用を考慮していませんでした。 我々は緑内障と診断された個人をIOP分析から除外し、薬物使用の影響を大幅に軽減しましたが、緑内障と診断されずにIOP低下薬を服用している個人を除外することにはなりません。 さらに、ほとんどの参加者の UKB での IOP 測定は 1 回しか行われていないため、複数の測定値の中央値によって緩衝される可能性がある誤差が発生しやすい可能性があります。 上記の要因は両方とも、まれな遺伝的変異が IOP に及ぼす影響の推定に影響を与える可能性があります。 第 2 に、緑内障の診断は病気の発症後ずっと後に下されることが多いため、一定の割合の対照が未診断の緑内障を患っていると予想でき、それが効果量の推定に影響を与える可能性があります。 第三に、ヒトのANGPTL7遺伝子はMTOR39のイントロン28内に位置するため、ANGPTL7の変異体もMTORの機能に影響を与える可能性があります。 可能性としてはありますが、IOP および緑内障に対する影響が MTOR によるものである可能性は低いです。次の理由からです。(i) 変異体は ANGPTL7 のタンパク質を変化させると予測されていますが、MTOR に対する明らかな予測された機能的影響はありません。 (ii) 変異体が ANGPTL7 に機能的な影響を与えることを示唆するデータを示します。 (iii) IOP 調節における ANGPTL7 の役割を確立するマウスのデータを示します。

要約すると、我々の遺伝的および薬理学的結果は、ANGPTL7がヒトおよびマウスにおけるIOPの正常な生理学的調節に関与していることを示している。 実験動物の目に過剰な量の mAngptl7 タンパク質が存在すると、IOP が病理学的レベルまで上昇するため、ヒトにおける ANGPTL7 の上方制御は、POAG を引き起こす IOP 上昇の原因である可能性があります。 したがって、我々はANGPTL7をPOAGの治療標的として探索するための優れた候補として提案する。

すべての参加者はインフォームドコンセントを提供し、研究は各施設の個々の治験審査委員会によって承認されました。 英国バイオバンクは、英国を対象とするノースウェスト多施設研究倫理委員会（MREC）の承認を得ています。 また、イングランドとウェールズでは、人々の参加を呼びかけるための情報へのアクセスを得るために患者情報諮問グループ（PIAG）の承認も求めた。 DiscovEHR 研究は、Geisinger の治験審査委員会 (IRB) によって承認されました。 BioMe Biobank は、マウント サイナイの IRB にある Icahn School of Medicine によって承認された進行中の研究バイオリポジトリです。 ルンド大学の倫理委員会はマルメの食事とがんの研究 (LU 51 ～ 90) を承認し、参加者全員が書面によるインフォームドコンセントを提出しました。 CGPS 研究 (H-KF-01-144/01) は、首都圏倫理委員会およびデンマークデータ保護庁によって承認されました。 エストニアバイオバンクでの研究はヒト遺伝子研究法によって規制されており、参加者全員が広範なインフォームドコンセントに署名しています。 現在の研究に対する治験審査委員会の承認は、タルトゥ大学の研究倫理委員会によって承認されました (承認番号 236/T-23)。 POAAGG 研究では、被験者の登録と再接触の承認がペンシルベニア大学治験審査委員会から得られました。 フィンゲン バイオバンクは、ヘルシンキおよびウーシマー病院地区の倫理調整委員会によって評価され、承認されました。

IOPとの関連性は、英国バイオバンク（UKB）およびガイジンガー・ヘルス・システム（GHS）のMyCode Community Health Initiativeコホートからのヨーロッパ系祖先の合計101,678人および27,529人を対象に検査された。 UKB は、2006 年から 2010 年の間に英国の 22 の検査センターを通じて募集された 40 歳から 69 歳の人々を対象とした人口ベースのコホート研究です40。GHS MyCode 研究は、ペンシルベニア州中部および東部の患者を対象とした医療制度ベースのコホート研究です（米国） ）2007年から2019年に採用された41。 アフリカ系の個人における IOP 関連検査には、UKB の 4,114 名と、ペンシルバニア大学ペレルマン医学部で実施された一次開角アフリカ系アメリカ人緑内障遺伝学 (POAAGG) 研究の 3,167 名が含まれました 42。 緑内障診断コード（ICD-10 H40）または自己申告の緑内障（UKBフィールドID：6148および20002）を持つすべての参加者をIOP分析から除外しました。

ANGPTL7 バリアントと緑内障の関連性は、UKB、GHS、マウント シナイ BioMe コホート (SINAI)、マルメの食事とがんの研究 (MALMO)43、エストニア バイオバンク (EstBB)44、トロンデラーグ健康研究 (HUNT) の 8 つの研究で検証されました。 ）45、FinnGen、フィンランドの研究、コペンハーゲン一般人口調査およびコペンハーゲン市心臓調査（CGPS-CCHS）46。 合計で最大40,042件の症例（UKB: 12,377、GHS: 8032、SINAI: 409、MALMO: 2395、EstBB: 7629、HUNT: 3874; CPGS-CCHS: 1863; FinnGen: 3463）および947,782件のヨーロッパの対照があった。緑内障の解析では、アフリカ系の5,153例（UKB：448、POAAGG：3,444、SINAI：1,261）と21,650人の対照を対象とした。

UKBのIOPは、Ocular Response Analyzer (Reichert Corp.、ニューヨーク州バッファロー)を使用して各眼で測定しました。 過去 4 週間以内に目の手術を受けたことがある、または目の感染症があると報告した参加者は、このテストから除外されました。 Ocular Response Analyzer は、ゴールドマン相関 IOP (IOPg) と角膜補償 IOP (IOPcc) という 2 つの形式の IOP を計算します。 IOPg は、IOP 測定のゴールドスタンダードであるゴールドマン圧平眼圧計 (GAT) で測定された IOP に最も近似しています。一方、IOPcc は、角膜生体力学の影響を除去するように調整された IOP の測定値を提供します 47。 この研究では、この測定値が他のコホートの IOP 測定値と最も類似しているため、IOPg に焦点を当てました。本明細書では IOPg を IOP と呼びます。 POAAGG の IOP は GAT を使用して測定されました。 GHS では、GAT、Tono-pen、I-Care などのいくつかの機器から IOP 測定値が取得され、Ocular Response Analyzer48 からの IOPg 測定値と相関しています。 IOP薬を処方されていないGHS患者については、入手可能なすべてのIOP測定値の中央値を使用しました。 IOP薬を処方されている個人については、IOP薬の開始日より前に入手可能なIOP測定値の中央値を使用しました(利用可能な場合)。 薬物治療を受けていない IOP 値が得られなかった個人は、IOP 遺伝子解析から除外されました。 IOP の関連分析では、以下の症状を持つ個人を除外しました。(1) 緑内障と診断されている。 (2) 平均値から 5 標準偏差を超えて離れた IOP 測定値。 (3) 両眼の差が10mmHg以上ある場合。 各個人の両目の間の平均 IOP 測定値を導き出しました。 両目の IOP 測定値が利用できない場合には、片目のみの IOP が使用されました。

各コホートにおける緑内障の定義の詳細は、補足方法に記載されています。 簡単に説明すると、GHS、SINAI、MALMO、HUNT、EstBB、FinnGen (v.R3)、および CGPS-CCHS における緑内障の症例は、外来患者または入院患者の電子医療記録に ICD-10 H40 診断コードが存在することによって定義されました。 UKB では、緑内障症例は、ICD-10 H40 と診断された個人、または自己報告された緑内障 (UKB フィールド ID: 6148 または 20002) のいずれかを持つ個人として定義されました。 POAAGG コホートでは、緑内障の専門医による眼科検査に基づいて緑内障の症例と対照が分類され、緑内障の疑いのある患者も症例に含まれていました42。

補足方法に記載されているように、高カバー率の全エクソーム配列決定と遺伝子型決定は Regeneron Genetics Center 49,50 で実施されました。 REGENIE v1.0.4351 (UKB、GHS、MALMO、SINAI)、SAIGE52 (HUNT、EstBB、FinnGen)、またはロジスティック回帰 (CGPS-CCHS) を使用して、遺伝子変異またはその遺伝子負荷の IOP および緑内障との関連性を推定しました。 分析は、必要に応じて、年齢、2 歳、性別、年齢別交互作用項、実験バッチ関連の共変量、および遺伝的主成分について調整されました。 コホート固有の統計分析の詳細は、補足方法で提供されます。 コホート全体の結果は、逆分散加重メタ分析を使用してプールされました。 UKB および GHS で実施された PheWAS 分析の詳細は、補足方法で提供されます。 ウエスタンブロッティングおよびELISA分析は3つの独立した生物学的複製に対して繰り返され、データは平均値±SEMとして表示されます。 ELISA 分析のために技術的な反復 (n = 3) を実行しました。 P 値は、複数グループ分析のための Tukey の多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって計算されました (補足データ 1)。 合計 12 個の眼を使用して、マウスの眼における mAngptl7 レベルの増加の影響を試験し、スチューデントの t 検定を使用して、結果として生じる IOP 変化の有意性を計算しました。 IOPは33匹のWTマウス、41匹のAngptl7 KOマウス、および15匹のAngptl7 Hetマウスで測定され、4匹のWTマウスと7匹のAngptl7 KOマウスで従来の流出機能が測定されました。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して、異なる遺伝子型間の結果の統計的有意性を計算しました。 mAngptl7 の in vivo siRNA ノックダウンでは、siRNA#3、siRNA#5、PBS 処理およびナイーブ コントロールに対してそれぞれ 8、6、6、および 5 個のマウスの目を使用しました。 統計的有意性は、ダネットの事後分析を伴う一元配置分散分析を使用して計算されました (補足データ 1)。

Regeneron 内に由来する HEK293 細胞は、10% FBS および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した 4.5 g/L D-グルコース、(+) L-グルタミン、(-) リン酸ナトリウム、(-) ピルビン酸ナトリウムを含む DMEM 培地で培養されました。グルタミン (Invitrogen)、5% CO2 下の加湿雰囲気下、37 °C。 トランスフェクションの前日に、HEK293 細胞を 10% FBS を補充した OptiMEM に播種しました。 24 時間後、細胞を FuGENE 6、および次のタンパク質をコードする 10 μg の pcDNA 3.1(+) でトランスフェクトしました:ANGPTL7 WT、Gln175His、Arg177* および Trp188*。 24 時間後、培地を 2% FBS OptiMEM に交換しました。 翌日、細胞を、それぞれタンパク質およびRNA分析のために、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(BRAND)またはTRIzol試薬(Invitrogen)を補充したRIPA緩衝液中に収集した。 上清をエッペンドルフチューブに移し、下流のタンパク質分析のためにすぐに急速冷凍しました。 ウェスタンブロット分析は、ANGPTL7 に対するウサギポリクローナル抗体 (10396-1-AP ProteinTech) を 1:1000 希釈で使用し、標準的な手順で実行しました。 ANGPTL7は、製造業者の指示に従ってELISAによって定量した(LS-F50425 Life Sciences)。 細胞溶解物を 1:1000 に希釈しました。 上清を 1:10,000 に希釈しました。 ＥＬＩＳＡプレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を介して４５０ｎｍで読み取った。

メーカーの指示に従って、TRIzol試薬(Invitrogen)およびRNeasyキット(Qiagen)を使用して全RNAを抽出し、RNase-free DNase I(Promega)で処理した。 cDNAは、Superscript VILO cDNA合成キット(Invitrogen)を使用して合成した。 Taqman 分析は、QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems) の TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) と、ANGPTL7 (Hs00221727 - Applied Biosystems) および GAPDH (Hs02786624_g1 - Applied Biosystems) 用の市販のプライマーおよびプローブを使用して実行しました。

すべての動物プロトコルは、Regeneron の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) および視覚および眼科研究協会 (ARVO) の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明に従って、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 。 63% C57BL/6NTac および 37% 129SvEvTac バックグラウンドの Angptl7-/- マウスは、Regeneron Pharmaceuticals によって VelociMouse® テクノロジーを使用して作製されました53。 ヘテロ接合マウス (Angptl7+/-) を飼育して、年齢を一致させた野生型、het および KO 同腹子を生成し、生後 3 ～ 4 か月で実験に使用しました (性別混合)。 これらのマウスの眼の解剖学的構造は、光コヒーレンストモグラフィーを使用して特徴付けられました。 KO マウスの生成および特性評価に関する詳細な方法は、補足方法に記載されています。 in vivo siRNA 実験には、Jackson Labs の生後 3 ～ 4 か月の C57BL/6 J 雄マウスを使用しました。

マウスに麻酔をかけ、Angptl7 注射の開始前とその後 6 日間毎日、TonoLab リバウンド眼圧計 (コロニアル メディカル サプライ、ニューハンプシャー州フランコニア) を使用して両目の IOP を測定しました 54、55、56。 Angptl7 siRNA をテストする場合、実験開始前に各眼の IOP を測定し、その後は研究終了まで毎週測定しました。 両目の眼圧測定は 3 ～ 5 分以内に完了しました。 1 つの IOP 測定値を生成するために、各眼で 6 回の正確な単一測定が行われました。 それぞれの目について 5 つの IOP 測定値を取得し、各時点でのそれらの測定値の平均を使用しました。

房水流出機能（C）は、生きたマウスにおける定流量注入技術を使用して測定されました55、56、57、58。 １００／１０ｍｇ／ｋｇのケタミン／キシラジンカクテルを使用してマウスを麻酔した。 必要に応じて、この用量の 4 分の 1 から半分が麻酔維持のために投与されました。 角膜麻酔のために、1 ～ 2 滴の塩酸プロパラカイン (0.5%) (ボシュロム社) を両目に局所的に塗布しました。 30 ゲージの針を使用して、両眼の前房にカニューレを挿入し、角膜縁の 1 ～ 2 mm 前方に挿入し、前房を横切ってカニューレ挿入点の反対側の眼房角の点まで押し込みました。虹彩、前水晶体嚢上皮、または角膜内皮に触れること。 各カニューレ挿入針は、連続測定のために、事前に校正された（血圧計、Diagnostix 700、American Diagnostic Corporation、米国ニューヨーク州ホーポージ）フロースルー BLPR-2 圧力トランスデューサー（World Precision Instruments [WPI]、米国フロリダ州サラソタ）に接続されました。灌流システム内の圧力。 角膜の乾燥を防ぐために、ジェンテアル (Alcon) を各目に 1 滴ずつ投与しました。 圧力変換器の反対側の端を、さらなるチューブを介して、微量透析注入ポンプ（SP200Iシリンジポンプ；WPI）に装填された1mlシリンジに接続した。 チューブ、トランスデューサー、およびシリンジはすべて滅菌 DPBS (Gibco) で満たされました。 各圧力トランスデューサーからの信号は、TBM4M ブリッジ アンプ (WPI) および Lab-Trax アナログ デジタル コンバーター (WPI) を介してコンピューターに渡され、仮想チャート レコーダー (LabScribe2 ソフトウェア; WPI) に表示されました。 最初に目に0.1μl/分の流量で注入した。 圧力が 10 ～ 30 分以内に安定したら、圧力測定値を 5 分間記録し、流量を 0.2、0.3、0.4、および 0.5 μl/min に順次増加させました。 各流量で 3 分間隔で 3 つの安定した圧力が記録されました。 各動物の各眼のＣは、横軸の流量に対する縦軸の平均安定化圧力のプロットの傾きの逆数として計算された。

ガラス製マイクロシリンジ（体積５μＬ；Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を備えた３３ゲージ針を使用して、マウスの眼にＡｎｇｐｔｌ７タンパク質／ｓｉＲＮＡを注射した。 硝子体内注射の場合、眼を前方に向けて、水晶体後部または網膜に触れないよう注意しながら、強膜赤道を通して約４５度の角度で針を硝子体腔に挿入した。 Angptl7タンパク質（カタログ番号4960-AN-025; R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）またはsiRNA（Alnylam Pharmaceuticals、Supplementary Methods製）またはPBS（1uL）を1分間かけて硝子体に注射した。 次いで、針をさらに 45 秒間所定の位置に放置し (混合を促進するため)、その後、急速に引き抜きました。 試験した6つのプローブすべてのsiRNA配列を表2に示します。Angptl7タンパク質の前房内注射前および注射中に、マウスを酸素を含むイソフルラン(2.5%)で麻酔しました(0.8L/分)。 局所麻酔のために、両目に0.5%プロパラカインHCl(Akorn Inc.)を1～2滴投与した。 それぞれの眼を前方に向けて、虹彩、前水晶体嚢上皮、または角膜内皮に触れないように注意しながら、輪部領域のすぐ上の角膜を通して角膜に平行な角度で前房に針を挿入した。 最大 1 μL の Angptl7 タンパク質または PBS を 30 秒かけて各眼に注射し、その後針を抜きました。 注射は0日目に1回のみ投与されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

主要な数値の基礎となるソースデータは補足データ 1 に提供されています。主要な論文に表示されるブロットのトリミングされていない未編集の画像は補足データ 2 に提供されています。このレポートに記載されているすべての全エクソームシークエンシング、ジェノタイピングチップ、および代入配列は公的に入手可能です。英国バイオバンク データ アクセス プロトコル経由で登録研究者に送信されます。 データへのアクセスのための登録に関する追加情報は、http://www.ukbiobank.ac.uk/register-apply/ でご覧いただけます。 エクソーム配列全体の詳細については、https://www.ukbiobank.ac.uk/media/kqjmdwfg/access_064-uk-biobank-exome-release-faq_v10.pdf を参照してください。 チップおよび代入配列に関する詳細情報は、https://www.ukbiobank.ac.uk/media/cffi4mx5/ukb-genotyping-and-imputation-data-release-faq-v3-2-1.pdf で入手できます。 DiscovEHR とペンシルバニア大学のエクソーム配列決定およびジェノタイピングのデータは、それぞれガイジンガー ヘルス システムとペンシルバニア大学とのデータ転送契約を通じて、要求に応じて有資格の学術的非営利研究者が利用できるようにすることができます。 HUNT、CGPS-CCHS、およびエストニアコホートの遺伝データは、それぞれの機関に連絡することで入手できる場合があります。 FinnGen R3 データには、https://www.finngen.fi/ からアクセスできます。 この原稿に記載されている Regeneron 資料は、資格のある学術研究者が当社のポータル (https://regeneron.envisionpharma.com/vt_regeneron/) を通じてリクエストに応じて入手できる場合があります。 特定の独自の試薬を提供できない特定の状況では、同様の動作をする代替分子が提供される場合があります。 資料の共有方法に関する追加情報は、Regeneron の前臨床コラボレーション電子メール アドレス ([email protected]) に連絡することで入手できます。

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この取り組みを可能にしてくださった皆様に感謝いたします。 特に：英国バイオバンクチーム、その資金提供者、この研究に貢献し支援した加盟機関の献身的な専門家、そして最も特に英国バイオバンク参加者なしではこの研究は不可能でした。 エクソーム配列決定は、UK Biobank Exome Sequencing Consortium (つまり、Bristol Myers Squibb、Regeneron、Biogen、Takeda、AbbVie、Alnylam、AstraZeneca、および Pfizer) によって資金提供されました。 この研究は、英国バイオバンク リソース (申請番号 26041) を使用して実施されました。 EstBB、この研究への貢献に対するエストニアのバイオバンクの参加者とスタッフ全員に感謝します。また、EstBB の分析作業の一部はタルトゥ大学のハイパフォーマンス コンピューティング センターで行われました。 LMとKKは、エストニア研究評議会PRG184からの助成金と、欧州地域開発基金（プロジェクト番号2014-2020.4.01.15-0012）を通じた欧州連合からの助成金によって支援されました。 FinnGen 研究の参加者と研究者に感謝の意を表します。 また、DiscovEHR コラボレーションに参加してくださった MyCode Community Health Initiative の参加者にも感謝します。 この研究は Regeneron Pharmaceuticals から資金提供を受けました。 JOB は、National Eye Institute (#R01EY023557-01)、Vision Research Core Grant (P30 EY001583)、および NIH Grant (LM010098) によって支援されました。 資金は、FM カービー財団、失明防止研究、UPenn 病院女性訪問者委員会、ポール & エヴァニナ ベル マッコール財団トラストからも提供されています。 ペレルマン医科大学の眼科とペンシルベニア州フィラデルフィアの退役軍人病院も支援を提供した。 資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。 トロンデラーグ健康調査（HUNT調査）は、HUNT研究センター（NTNU医学健康科学部、ノルウェー科学技術大学）、トロンデラーグ郡議会、中央ノルウェー地方保健局、およびノルウェー公共研究所の共同研究です。健康。 HUNT のジェノタイピングは国立衛生研究所の資金提供を受けました。 ミシガン大学; ノルウェー研究評議会。 中央ノルウェーの教育、研究、イノベーションのための連絡委員会。 聖オラフ病院とNTNU医学健康科学部との共同研究委員会。 SS は、デンマークの独立研究基金 (Sapere Aude Research リーダー、助成金番号 9060-00012B) から資金提供を受けました。 VRMC は、R21EY028273-01A1 およびリサ ディーン モーズリー財団助成金から資金提供を受けました。

Regeneron Genetics Center、タリータウン、ニューヨーク州、10591、米国

カビタ・プラヴィーン、ローレン・ガースキー、アリアン・H・エアー、トリカラダルシ・ペルサウド、ローレンス・ミロシオ、シルビオ・アレッサンドロ・ディ・ジョイア、スティーヴン・チェン、エリック・ジョルゲンソン、ダドン・リー、アレクサンダー・リー、イーライ・スタール、ディラン・サン、ターニャ・M・テスロビッチ、ゴンサロ・R・アベカシス、マイケル・カンター、アンドリュー・デューブラー、アリス・エコノマイデス、ルカ・A・ロッタ、ジョン・D・オーバートン、ジェフリー・G・リード、アラン・シュルディナー、キャサリン・シミノビッチ、クリスティーナ・ビーチャート、ケイトリン・フォーサイス、エリン・D・フラー、ジェンファ・グ、マイケル・ラタリ、アレクサンダー・ロペス、トーマス・D・シュライヒャー、マリア・ソティロプロス・パディラ、ルイス・ウィドム、サラ・E・ウルフ、マナシ・プラダン、キア・マヌーチェリ、リカルド・H・ウロア、シャオドン・バイ、スガンティ・バラスブラマニアン、スーイン・バオ、ボリス・ブートコフ、シーイン・チェン、ギス・エオム、ルーカス・ハベガー、アリシアホーズ、シャリーフ・カリド、オルガ・クラシェニニナ、ルーエル・ランシュ、アダム・J・マンスフィールド、エヴァン・K・マックスウェル、モナ・ナフデ、ショーン・オキーフ、マックス・オレルス、ラズヴァン・パネア、トミー・ポランコ、アイーシャ・ラソール、ウィリアム・サレルノ、キャシー・サン、アメリア・アヴェリット、ニランジャナ・バナジー、サミール・マルホトラ、ディーピカ・シャルマ、ジェフリー・C・ステイプルズ、アシシュ・ヤダブ、ジョシュア・バックマン、エイミー・ダマスク、リー・ドビン、マヌエル・アレン・レベス・フェレイラ、アルコプラボ・ゴーシュ、クリストファー・ギリース、ヒュン・ミン・カン、マイケル・ケスラー、ジャック・コスミッキ、ナン・リン、ダレン・リュー、アダム・ロック、ジョナサン・マルキーニ、アンソニー・マルケッタ、ジョエル・ムバッチョー、アーデン・モスカティ、チャールズ・ポールディング、カルロ・シドーレ、渡辺京子、ビン・イェ、ブレア・チャン、アンドレイ・ジヤディノフ、ミシェル・G・ルブラン、ジェイソン・マイティ、リンドン・J・ミトノール、ニルパマニシュタラ、ナディア・ラナ、マーカス・B・ジョーンズ、ゴンサロ・R・アベカシス、マイケル・N・カンター、カティア・カラリス、アリス・エコノミデス、ジュジー・デラ・ガッタ、マヌエル・A・フェレイラ、アリス・バラス、ジョバンニ・コッポラ

Regeneron Pharmaceuticals, Inc.、タリータウン、ニューヨーク州、10591、米国

ガウラン・C・パテル、マシュー・D・スティル、タヴェ・ヴァン・ジル、ウェン・フューリー、ブリジェシュクマール・パテル、ジェレミー・S・ラビノウィッツ、サブリナ・ウォーリー、ホア・ヤン、サルタック・ザヴェリ、イン・フー、ジョナサン・ウェイン、アリス・エコノミデス、ジョージ・D・ヤンコプロス、カーメロ・ロマーノ

KG Jebsen Center for Genetic Epidemiology、公衆衛生看護学部、NTNU、ノルウェー科学技術大学、7030、トロンハイム、ノルウェー

ベン・ブランプトン、ビョルン・オラフ・アスヴォルド、クリスチャン・フヴィーム

HUNT 研究センター、公衆衛生看護学部、NTNU、ノルウェー科学技術大学、7600、レヴァンゲル、ノルウェー

ベン・ブランプトン、ビョルン・オラフ・アスヴォルド、クリスチャン・フヴィーム

セント・オラヴス病院トロンハイム大学病院診療所、7030、トロンハイム、ノルウェー

ベン・ブランプトン

エストニアゲノムセンター、ゲノミクス研究所、タルトゥ大学、タルトゥ、エストニア

クリスティ・クレブス、アンドレス・メツパル、マリ・ネリス、リードク・マジ、トゥヌ・エスコ、リリ・ミラニ

トロンハイム大学病院聖オラヴ病院内分泌内科、7030、トロンハイム、ノルウェー

ビョルン・オラフ・アスヴォルド

米国ペンシルバニア州フィラデルフィア、ペンシルベニア大学パールマン医学部眼科

ヴェンカタ RM チャヴァリ、ハリニ V. グディセワ、レベッカ サロー & ジョーン M. オブライエン

Alnylam Pharmaceuticals, Inc、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02142、米国

サラ・ハイド、ステファニー・ルフェーブル、ジェームズ・マクニンチ、スコット・ウォルドロン

Bayer AG、医薬品、研究開発、13342、ベルリン、ドイツ

クラウディア・シュールマン

コペンハーゲン大学病院、リグショスピタレット、臨床生化学部門、コペンハーゲン、デンマーク

アンヌ=ソフィー・ザイデリン、アンヌ・ティビャルグ=ハンセン、ステファン・ステンダー

米国ミシガン州アナーバーのミシガン大学内科循環器内科

クリステン・ウィラー

米国ミシガン州アナーバーのミシガン大学計算医学および生命情報学部

クリステン・ウィラー

ミシガン大学人類遺伝学部、アナーバー、ミシガン州、米国

クリステン・ウィラー

ルンド大学臨床科学部マルメ、マルメ、スウェーデン

オーレ・メランデル

スコーネ大学病院、救急内科、マルメ、スウェーデン

オーレ・メランダー

ガイジンガー、ダンビル、ペンシルベニア州、17821、米国

ランス・J・アダムス、ジャッキー・ブランク、デイル・ボディアン、デレク・ボリス、アダム・ブキャナン、デビッド・J・ケアリー、ライアン・D・コロニー、F・ダニエル・デイビス、ダスティン・N・ハートツェル、メリッサ・ケリー、H・レスター・キルヒナー、ジョセフ・B・リーダー、デヴィッド・H・レッドベター、J・ニール・マナス、クリスタ・L・マーティン、ラグ・P・メトパリー、ミシェル・マイヤー、トゥーラジ・ミルシャヒ、マシュー・エチェンス、トーマス・ネイト・パーソン、クリストファー・スティル、ナターシャ・ストランド、エイミー・スターム、ジェン・ワグナー＆マーク・ウィリアムズ

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すべての著者は、重要な知的内容についての原稿の批判的なレビューと、出版のための原稿の提出の最終承認に貢献しました。 概念化：KP、GP、AB、CR、GC データキュレーション：DL、MNC 遺伝子解析：KP、LG、MAF、AHA、SADG、AL、TMT、CS、DS、KK、BB、SS、ES、EJ 資金調達: GDY、GRA、AB、JMB、CR、LM、OM、SS、KH マウス実験: GP、BP、SW、HY、WF、SZ、JSR、WF siRNA 設計および開発: SL、JM、S.Waldron、SHインビトロ実験: GDG、TP、LM、MDS プロジェクト管理: EC、MBJ データセット: JMB、VRMC、HVG、RS、BB、KH、BOA、CW、KK、LM、。 SS、AS、AT、。 OM 監督: MAF、GDG、YH、KH、LM、KK、AE、JW、AB、CR、GC 執筆—初稿: KP、GP、GDG、TVZ、CR、GC すべての著者は資金の確保、研究デザイン、および研究に貢献しました。見落とし。 著者全員が原稿の最終版をレビューしました (RGC 管理およびリーダーシップ チーム)。 CB、CF、AL、および JDO がサンプルのジェノタイピングを実行し、責任を負います。 CB、CF、EDF、ML、MSP、LW、SEW、AL、および JDO が実行され、エクソーム配列決定を担当します。 TDS、ZG、AL、JDO が研究室の自動化を考案し、担当しています。 MSP、KM、RU、および JDO は、サンプル追跡とライブラリ情報管理システムを担当します。 XB、AH、OK、AM、SO、RP、TP、AR、WS、および JGR が実行され、エクソームおよび遺伝子型データを生成するために必要なコンピューティング ロジスティクス、分析、およびインフラストラクチャを担当します。 GE、MO、MN、JGR は、コンピューティング インフラストラクチャの開発と運用サポートを提供しました。 SB、S.Ba、SC、KS、SK、および JGR は、バリアントおよび遺伝子の注釈とバリアントの機能的解釈を提供しました。 EM、RL、BB、AB、LH、JGR は、ゲノム データを分析するための分析プラットフォームと計算手法を考案し、開発、導入する責任を負います。 著者全員がこのプロジェクトの臨床情報学 (臨床情報学) に貢献しました。 著者全員がプロジェクトの分析分析に貢献しました (翻訳および分析遺伝学)。 著者全員が、すべての研究活動、計画、実行の管理と調整に貢献しました。 著者全員が原稿の最終版のレビュープロセスに貢献しました (研究プログラム管理)。

アリス・バラス、カルメロ・ロマーノ、ジョバンニ・コッポラとの通信。

著者は、次のような競合する利益を宣言します。Regeneron の著者は、会社から給与を受け取り、会社のオプションや株式を所有しています。 CW の配偶者は Regeneron Genetics Center の従業員です。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Saidas Nair、Lulin Huang、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な担当編集者: Eve Rogers。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Praveen, K.、Patel, GC、Gurski, L. 他。 ANGPTL7、眼圧上昇および緑内障の治療標的。 Commun Biol 5、1051 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03932-6

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受信日: 2021 年 9 月 3 日

受理日: 2022 年 9 月 1 日

公開日: 2022 年 10 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03932-6

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