TLR5アゴニストは抗炎症作用を増強します

Communications Biology volume 6、記事番号: 31 (2023) この記事を引用

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免疫チェックポイント療法 (ICT) に対する一次抵抗性および適応抵抗性は、全生存期間の延長を達成する上で大きな障害となります。自然免疫活性化因子は、抗腫瘍の可能性を求めて積極的に研究されてきました。本明細書では、確立された高難治性トリプルネガティブ乳がんの同系4T1乳がんマウスモデルが、TLR5アゴニストであるフラジェリンまたはフラジェリン誘導体であるCBLB502のいずれかを、CTLA-4およびCTLA-4を標的とする抗体と組み合わせて腫瘍内治療した場合、生存率の向上を示したことを報告する。 PD-1。長期生存マウスは、腫瘍の再チャレンジ時に免疫記憶を示し、自然免疫と適応免疫の両方に関与する独特の免疫活性化サイトカインプロファイルを示しました。 G-CSF および CXCL5 の血清レベルが低いこと (IL-15 が高いことも同様) は、生存率の向上と相関する予測バイオマーカーの候補でした。 CBLB502 による ICT の増強は、免疫原性の低い B16-F10 黒色腫腫瘍でも観察されました。免疫チェックポイント療法と TLR5 アゴニストの併用は、ICT 抵抗性の固形腫瘍を治療するための新しい治療戦略を提供する可能性があります。

免疫チェックポイント療法 (ICT) は、持続的な治療効果を備えたがんに対する新たな治療の場を切り開きました 1,2。 ICT で標的とされる 2 つのよく特徴付けられた免疫チェックポイント制御因子は、PD-1 と CTLA-43,4 です。 PD-1 は、免疫抑制性 T-reg のアポトーシスを阻害し、抗原特異的 T 細胞のアポトーシスを促進することにより、免疫活性を調節します5。 PD-1 は、B 細胞の活性化を阻害することも知られています6。対照的に、CTLA-4 は T 細胞の活性化を妨げると考えられています 4,5。しかし、がん患者の大部分はこれらの治療に反応しないか、一定期間反応した後に再発します7。耐性のメカニズムに広く見られる共通のテーマは、腫瘍抗原提示プロセスの多くの段階のいずれかに欠陥があるために、持続的な適応反応を引き出すことができないことです。これらの欠損は、おそらく、固有または後天性の低抗原タンパク質発現および/または腫瘍細胞または腫瘍微小環境における抗原提示シグナル伝達と免疫活性化の共役解除によって引き起こされると考えられています。耐性のメカニズムとは無関係に、自然免疫の直接的な活性化が、免疫チェックポイントに基づく治療に対する腫瘍耐性を克服できる免疫応答を引き起こす可能性があります8。

最近の証拠は、自然免疫を利用する治療法が有望な抗腫瘍の可能性を示すことを示しています9。多くの研究において、鞭毛のある通性細胞内細菌であるネズミチフス菌は、前臨床モデルで腫瘍退縮を誘導します10、11、12、13、14、15、16、17。この概念に基づいて、サルモネラ菌種を用いた治療試験が進行中です (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT03762291)。サルモネラ菌の治療効果は、細菌の抗原性と、Toll 様受容体 (TLR) による病原体関連分子パターンの宿主免疫媒介認識の活性化によって駆動される可能性があります 14、18、19、20。驚くことではないが、多くの TLR アゴニストが抗腫瘍活性を誘発することが示されている 21、22、23、24。特に、TLR5 アゴニストである細菌性フラジェリンによる治療 25 は、結腸がん、乳がん、および前立腺がんのさまざまな異種移植モデル、および多くのマウス自然発生腫瘍モデル 23、26、27、28、29、30 で強力な抗腫瘍反応をもたらします。 31. 興味深いことに、Tlr5 発現レベルが高いほど、乳がん、肺がん、卵巣がん患者の生存期間の延長と相関しています 32。 TLR5 媒介の抗腫瘍効果の正確なメカニズムはまだ解明されていませんが、TLR5 は、おそらく NF-κB26、32、33 を含む炎症誘発性経路の活性化を介して、細菌フラジェリン 25 に対する自然免疫応答を媒介することが知られています。興味深いことに、TLR5 は、ナイーブ CD4+ T 細胞活性化中の CD28 共刺激役割と同様の方法で、CD4+ T 細胞上で共刺激受容体として作用することにより、適応免疫活性化を媒介する可能性もあります 34。したがって、抗腫瘍反応はフラジェリンに対する宿主免疫反応の付随的な効果である可能性があります。 TLR5 媒介免疫原性応答は、臨床応用に適したフラジェリン由来試薬の探索につながりました。 CBLB502 (Entolimod) は、Salmonella enterica 由来の組換えフラジェリンタンパク質フラグメントで、TLR5 アゴニストおよび NF-κB 炎症反応の活性化因子として作用します 35,36。多くの前臨床研究において、CBLB502 による治療は、自然免疫系の構成要素の活性化を通じて抗腫瘍効果と抗転移効果を示しました 37,38,39,40,41。 CBLB502 の安全な全身投与は、齧歯動物、非ヒト霊長類、およびヒトにおいて実証されており 35,42,43 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT01527136)、他の TLR ファミリーメンバーのアゴニストによる治療と比較して、潜在的に重要な進歩である。がん治療の背景44、45、46 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT00960752)。今回我々は、免疫原性4T1乳がん固形腫瘍モデルと免疫原性の低いB16-F10黒色腫腫瘍モデルを用いて、TLR5アゴニストと免疫チェックポイント療法（ICT）の組み合わせを検討した。これらはいずれも悪性度が高く、標準治療に抵抗性のがんである47、48、49。これらのモデルで長期生存者が実証されれば、さらなる変革的努力に値する進歩とみなされるでしょう。

4T1 乳癌細胞の鞭毛および CBLB502 媒介 NF-κB 活性化を評価するために、連結された κB5 プロモーター領域とその後に生物発光 IκBɑ-FLuc 融合レポーター遺伝子で構成される κB5:IκBɑ-FLuc 転写レポーターを 4T1 細胞に安定的にトランスフェクトしました。 ,51。このレポーターは、内因性リガンド誘導性の IκBɑ 分解と新しい IκBɑ-FLuc 融合タンパク質 51 の生成を読み取り、動的な 2 相シグナルを生成します。細胞質では、IκBα が NF-κB 二量体を隔離し、不活化します。細胞表面上の TLR5 へのフラジェリン (または CBLB502) の結合により、IKK 媒介キナーゼ活性が開始され、その後のリン酸化、ユビキチン化、および内因性 IκBα およびレポーター融合タンパク質のプロテアソーム分解の標的化が開始されます 32,51。このメカニズムから予想されるように、これにより、フラジェリン処理培養物では最初の100分間（図1a、赤い矢印）、CBLB502処理培養物では最初の80分間（図1b、赤い矢印）に生物発光活性が減少しました。。続いて、放出された NF-κB 二量体は核に移動し、レポーターの κB5 プロモーター領域に結合し、新しい生物発光融合タンパク質の転写と翻訳を開始します。これにより、生物発光シグナルの第2段階の増加が生じ（図1a、b、緑色の矢印）、十分な時間が経過すると、他のNF-κB活性化リガンドで以前に観察されたように恒常性状態に戻りました32、52。全体として、フラジェリンまたはCBLB502のいずれかと4T1細胞をインキュベートすると、NF-κBシグナル伝達のサイクルを反映するIκBα-FLuc融合レポーターの濃度依存的な分解とその後の再合成が起こりました（図1a、b）。この細胞株では、フラジェリンと CBLB502 の最大半値有効濃度 (EC50) はそれぞれ >104 ng/mL と 3.1 ng/mL であり、NF-κB シグナル伝達経路を活性化する CBLB502 の効力が強化されていることを直接示しています (図 1)。 1c、d)。

pκB5:IκBαFLuc を安定して発現する 4T1 細胞を、t = 0 で指定のリガンドで刺激し、生物発光活性を 5 分ごとに 4 時間画像化しました。データは、正規化された光子束値（平均フォールド初期、フォールドビヒクル）として表示されます。 a pκB5:IκBαFLuc を安定発現する 4T1 細胞を、フラジェリン濃度を増加させて処理しました: 1 ng/ml (n = 7)、10 ng/ml (n = 2)、50 ng/ml (n = 2)、100 ng/ml ( n = 7)、500 ng/ml (n = 7)、750 ng/ml (n = 2)、1 μg/ml (n = 7)、2.5 μg/ml (n = 7)、3 μg/ml ( n = 5)、4 μg/ml (n = 5)、5 μg/ml (n = 7)、7.5 μg/ml (n = 5)、10 μg/ml (n = 7)、および TNFα 20 ng/ ml (n = 7)。エラーバーは、示された数の独立した実験に対する SEM を表します。 b pκB5:IκBαFLuc を安定発現する 4T1 細胞を、CBLB502 濃度を増加させて処理しました: 0.1 ng/ml (n = 3)、0.5 ng/ml (n = 3)、1 ng/ml (n = 3)、1.5 ng/ml (n = 3)、2.5 ng/ml (n = 3)、5 ng/ml (n = 3)、10 ng/ml (n = 3)、25 ng/ml (n = 3)、100 ng/ml (n = 3)、1 μg/ml (n = 3)、および TNFα 20 ng/ml (n = 3)。エラーバーは、示された数の独立した実験に対する SEM を表します。 c 4T1 細胞におけるフラジェリンの最大有効濃度の半分 (EC50) は、このモデルでは > 104 ng/mL です。 d 4T1 細胞における CBLB502 の半最大有効濃度 (EC50) は、このモデルでは約 3.1 ng/mL です。

CBLB502 による NF-κB 炎症促進性シグナル伝達の活性化は、自然免疫系の既知の活性化因子である TLR535 を介して媒介されます 25。 CBLB502が4T1癌細胞におけるNF-κBシグナル伝達の強力な活性化因子であることを考慮して（図1b、d）、CBLB502が4T1細胞サイトカインプロファイルの刺激性変化を誘発するのに十分であるかどうかをテストしました。 CBLB502 (1 μg/mL) による一晩の処理に応答して、4T1 レポーター細胞から馴化培地に分泌された 62 個のマウスサイトカインのタンパク質アレイを測定しました。補足図1aは、自然免疫を活性化する多くの上方制御されたサイトカインを特定しました（コントロールの倍数の順）：SCF（97倍）、L選択（29倍）、CCL11（7倍）、IL-3およびその受容体IL-3RB (それぞれ4倍および7倍)、CCL9 (7倍)、CCL20 (6倍)、(IL-12 p40/p70 (5倍)、CCL2 (5倍)、レプチン-R (4 倍)、CCL3 (4 倍)、IGFBP-5 (3 倍)、CCL19 (3 倍)、TNF-α (2 倍)のほか、VEGF などのより広範な免疫調節機能を発揮するものもあります。 (3 倍)、G-CSF (2 倍)、および IL-2 (3 倍) (補足表 1)。CXCL13 (0.3 倍)、CXCL12 (0.3 倍)、IL-6 (0.3-倍) (倍)、CD40 (0.4 倍)、および IL-4 (0.6 倍) はレベルの低下を示しました (補足図 1a および補足表 1)。これらのサイトカインのうち、CXCL1、CXCL5、および CCL2 は、他のサイトカインと比較して統計的に検出可能な増加を示しました。ビヒクル対照（両側、p ≤ 0.05）（補足図1b）これらのサイトカインが、好中球や単球などの自然免疫の成分の化学誘引物質であることが知られているのは注目に値します53、54、55、56。全体として、CBLB502 (1 μg/mL) のインキュベーションは、多くの炎症促進性および自然免疫動員サイトカインを上方制御することにより、細胞のサイトカインシグナル伝達プロファイルを再プログラムしました。

次に、フラジェリンまたはCBLB502の投与が、インビボで同系トリプルネガティブ乳がん4T1腫瘍モデルにおいて抗腫瘍応答を誘発できるかどうかを調査した。乳細胞癌は、BALB/c マウス (5 ～ 6 週齢) の右第 4 乳房脂肪体への 4T1 FUGW-FL 腫瘍細胞の同所性注射によって生成されました。各マウスの腫瘍の進行は、生物発光イメージング（BLI）と腫瘍体積のキャリパー測定を使用して毎週評価されました（補足図2a〜h）。同所性注射の 1 週間後に生物発光シグナルが検出され、腫瘍移植の成功が確認されました。腫瘍は触知可能であり、同所性注射後 2 週間で強い生物発光シグナルを示し、堅固な腫瘍増殖を示しました。次に、マウスを 4 つの異なる治療対照に無作為に割り付けました。ビヒクル対照、ICT (抗 PD-1 および抗 CTLA-4)、フラジェリンまたは CBLB502 治療、およびフラジェリンまたは CBLB502 と指定用量での ICT 治療の組み合わせです (表 1)。および配送方法（補足表2）。

4つの独立した実験を組み合わせた全生存率を図2aに示します。ビヒクル制御下（n = 25）または ICT のみの治療下（n = 23）のマウスはすべて研究終了までに死亡し、4T1 乳がんモデルの ICT 不応状態が確認されました。注目すべきことに、ビヒクル処置マウス１匹は、処置開始２週間前に光子束測定値が低いため、ＲＯＵＴ法を使用して外れ値として特定され、研究から除外された。腫瘍のないマウスは、腫瘍内フラジェリンのみの治療（初回投与量 10 μg/マウス）（n = 22）（生存者 1 名、p = 0.06、ログランク検定）および腫瘍内フラジェリン + ICT 治療（n = 22）で観察されました（生存者 3 名、p = 0.001、ログランク検定) (図 2a)。ビヒクル対照およびフラジェリンのみの治療対照下のマウスは、腫瘍体積の増加に伴い安定した生物発光シグナルを示しました（補足図2a、c）。興味深いことに、ICT治療マウス（ICTのみまたはフラジェリン+ICT治療マウス）は、治療開始後1週間で生物発光シグナル伝達の急激な減少を示しました（補足図2b、d、左パネル）。ただし、生物発光シグナル伝達の減少は、腫瘍体積の全体的な減少を伴っていませんでした（補足図2b、d、右パネル）。この観察結果には少なくとも 2 つの可能性が考えられます。細胞免疫浸潤の増加を伴う腫瘍細胞死、または生物発光カセットの選択的喪失またはサイレンシングです。相互に排他的ではありませんが、これらの結果は全体として、豊富な免疫細胞浸潤を伴う腫瘍微小環境における ICT 誘発性リモデリングを示しており、それ自体は生存を予測するものではありませんでした。

0週目に同所性4T1 FUGW-FL蛍光および生物発光レポーター細胞を移植され、2週目から4週目までICTの有無にかかわらずフラジェリンで処理されたBALB / cマウスのカプラン・マイヤー生存分析。ビヒクル対照（PBS）で処理されたマウス（ n = 25)、ICT (n = 23)、フラジェリン (n = 22)、およびフラジェリン + ICT 治療 (n = 22) を比較しました。フラジェリン + ICT 治療による治療は、ビヒクル対照による治療と比較して、生存率に対して統計的に有意な効果がありました (p = 0.0002、ログランク検定; p = 0.003、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定)。 ICT のみによる治療も、溶媒対照による治療と比較して、生存率に対して統計的に有意な効果を示しました (p = 0.01、ログランク検定; p = 0.03、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定)。しかし、ICT 治療を受けたマウスはすべて 8 週目までに死亡しました。フラジェリンのみによる治療は、ビヒクル対照による治療と比較して、検出可能な差を示さなかった（p = 0.06、ログランク検定; p = 0.08、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定）。 (b) CBLB502 (低用量) と ICT の併用治療により生存率が向上します。 0週目に同所性4T1 FUGW-FL蛍光および生物発光レポーター腫瘍細胞を移植し、2週目から4週目までICTの有無にかかわらずCBLB502（低用量）で処置したBALB/cマウスのカプラン・マイヤー生存分析。ビヒクル対照で処置したマウス(PBS) (n = 22)、ICT (n = 25)、CBLB502 (低用量) (n = 30)、および CBLB502 (低用量) + ICT (n = 30) を比較しました。 CBLB502 (低用量) + ICT 治療は、ビヒクル対照による治療と比較して、生存率に対して統計的に検出可能な効果を示しました (p = 0.002、ログランク検定; p = 0.001、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定)。 ICT 単独治療では、ログランク検定では検出可能な統計的差異は示されませんでしたが (p = 0.1)、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定では検出可能な統計的差異が示されました (p = 0.04)。 CBLB502（低用量）単独治療では、検出可能な統計的差異は示されませんでした（p = 0.8、ログランク検定、p = 0.3 Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定）。 c 0日目にB16-F10細胞を移植され、腫瘍移植後3日目にICTの有無にかかわらずCBLB502で処理されたC57BL / 6Jマウスのカプラン・マイヤー生存分析。ビヒクル対照（PBS）（n = 20）、ICT（n = 15）、CBLB502（n = 14）、および CBLB502 + ICT 治療（n = 39）で治療したマウスを比較しました。 CBLB502 + ICT 治療による治療は、ビヒクル対照による治療と比較して、生存率に対して統計的に有意な効果がありました (p = 0.003、ログランク検定; p = 0.01、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定)。 d 0週目に同所性4T1 FUGW-FL蛍光および生物発光レポーター腫瘍細胞を移植され、ビヒクル対照（PBS）で処理されたBALB / c Tlr5+/+またはTlr5-/-マウスのカプラン・マイヤー生存分析（それぞれn = 7）ビヒクルコホート）、ICT（Tlr5+/+ および Tlr5-/- マウスのそれぞれ n = 2 および n = 4）、CBLB502（Tlr5+/+ および Tlr5-/- マウスのそれぞれ n = 2 および n = 5）、および CBLB502 +ICT 治療 (n = 10、各 CBLB502 + ICT コホート) を比較しました。 CBLB502 (低用量) + ICT で治療した Tlr5+/+ マウスは、ビヒクル対照で治療した Tlr5+/+ マウスと比較した場合、生存率に対して統計的に検出可能な効果を示しました (p < 0.001、ログランク検定; p < 0.01、Gehan-Breslow-Wilcoxon)試験）またはCBLB502（it）+ ICTで治療したTlr5-/-マウス（p < 0.001、ログランク検定; p < 0.001、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定）。ビヒクル対照で処置したＴｌｒ５＋／＋マウスは、ビヒクル対照で処置したＴｌｒ５−／−マウスと比較した場合、生存において検出可能な統計的差異を示した（ｐ＜０．０３、ログランク検定；ｐ＜０．０３、Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。

CBLB502がフラジェリンよりもNF-κBシグナル伝達の活性化に対して優れた効力と有効性を示したこと（図1b、d）、およびCBLB502が自然免疫活性化サイトカインを刺激/動員したこと（補足図1a、b、および補足表1）を考慮して、我々はテストしましたCBLB502（低用量）による腫瘍内治療が、フラジェリンによる腫瘍内治療よりも強力な抗腫瘍反応を促すことができるかどうか。 4つの独立した実験（補足表2）を組み合わせた全生存率を図2bに示します。ビヒクル対照群の 1 匹のマウス (n = 22) は、予想外にも実験終了までに腫瘍がなくなりました。このマウスは、腫瘍移植後の最初の 2 週間で同等の生物発光シグナルを示し、腫瘍の成長に十分な細胞が移植されたことを示しました（補足図 2e、マウス 20）。しかし、実験中に触知できる腫瘍が検出されなかったことは注目に値し、腫瘍が顕著な増殖を確立する前にマウスが腫瘍細胞を隔離した可能性が高い。 CBLB502単独（低用量）（n = 30）による治療では、安定した生物発光シグナルと生存者なしの腫瘍増殖が生じました（補足図2g）。 ICT治療単独(n = 25)では、腫瘍のないマウス1匹(補足図2f、マウス23)と、最初は治療に反応したように見えたが、後にゆっくりと腫瘍が発生したマウス(補足図2f、マウス18)が得られた。）。以前の結果と一致して、ICT治療マウス（ICTのみまたはCBLB502（低用量）+ ICT治療）は、治療開始から1週間後に生物発光シグナルの急激な減少を示しました（補足図2f、h）。これは、初期の有意な損失と一致しています。 4T1 腫瘍細胞の。最も重要なことは、CBLB502 (低用量) + ICT 治療により、20% の腫瘍のないマウスが得られた (n = 30) (p = 0.001、ログランク検定; p = 0.001、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定) (図 2b) 。

我々は、フラジェリン治療コホートにおいてマウスに投与される用量に匹敵する、より高い腫瘍内CBLB502用量(CBLB502高用量)を試験した(表1)。 3 つの独立した実験 (補足表 2) では、CBLB502 (高用量) による治療により、CBLB502 (高用量) のみの治療 (n = 15) では 1 匹の腫瘍のないマウスが得られましたが、他の治療では生存者はいませんでした (溶媒 (n = 15) = 19）、ICT（n = 17）、CBLB502（高用量）+ ICT（n = 15））（補足図3a〜e）。興味深いことに、CBLB502（高用量）のみの治療でさらに1匹のマウスは腫瘍増殖の遅延を示しました（補足図3d、マウス3）。唯一の生存者（補足図3d、マウス5）は、ビヒクル対照との生存において統計的に検出可能な差異を示しました（p = 0.01、ログランク検定; p = 0.01、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定）。

我々はさらに、腹腔内（ip）注射によるCBLB502（低用量）の全身送達が、CBLB502（低用量）の腫瘍内送達と同様の反応を誘発できるかどうかを検討した。 2 つの独立した実験 (補足図 4a-e、補足表 2) では、CBLB502 (低用量) ip + ICT 治療により 10% の長期生存率が得られました (n = 20) (p = 0.01、ログランク検定; p = 0.01、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定）（補足図 4e、マウス 1 および 5）。ビヒクル対照（n = 8）およびCBLB502単独（低用量、腹腔内送達、n = 20）では長期生存者は発生しませんでしたが（補足図4b、d）、ICT処理マウス（n = 6）では1人の生存者が発生しました。この実験における長期生存者（p = 0.4およびログランク検定; p = 0.3 Gehan-Breslow-Wilcoxon検定、ビヒクル対照と比較）（補足図4c、マウス3）。

さらに、CBLB502 と ICT の併用治療が、B16-F10 黒色腫腫瘍モデルなどの免疫原性の低い腫瘍でも抗腫瘍応答を誘発できるかどうかを調査しました。 B16-F10 腫瘍細胞を右背側腹部に皮下注射することにより、C57BL/6J (生後 6 ～ 9 週齢) に黒色腫腫瘍が発生しました。腫瘍移植の 3 日後、マウスを 4 つの異なる治療対照に無作為に割り付けました: ビヒクル対照、ICT (抗 PD-1 および抗 CTLA-4)、CBLB502 治療、および示された用量および送達方法での CBLB502 と ICT 治療の併用(補足表 3)。 4 つの独立した実験からの全生存率を図 2c に示します。各マウスの腫瘍の進行は、腫瘍体積のキャリパー測定を使用して隔週で評価されました（補足図5）。 4つの独立した実験のうち、1匹のビヒクル対照マウスは実験期間中に触知できる腫瘍を発症しませんでした（補足図5a、マウス18）。 ICT のみで治療したすべてのマウス (n = 15) は研究終了までに死亡し (補足図 5b)、ワクチンを追加しなくても B16-F10 黒色腫腫瘍モデルの ICT 不応性状態が確認されました 57。 CBLB502 治療を受けた 1 匹のマウス (n = 14) のみが、研究終了までに腫瘍を発症しませんでした (補足図 5c、マウス 14)。しかし、生存曲線は、ビヒクル対照群との検出可能な統計的差異を示さなかった（p = 0.5、ログランク検定; p = 0.3、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定）（図2c）。 CBLB502とICTの併用治療により、研究78週目までに25％の腫瘍のないマウス（n = 39）が得られました（p = 0.001、ログランク検定; p = 0.003、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定）（図2c）および補足図5d）。したがって、TLR5 アゴニストと ICT の併用治療により、2 つの独立した ICT 抵抗性腫瘍モデルの in vivo 生存率が向上しました。

ICT治療と組み合わせてCBLB505で治療したマウスで観察された抗腫瘍応答を誘発するためにTLR5宿主受容体が必要かどうかをテストしました（図2d））。 Tlr5+/+ および Tlr5-/- マウスを 4T1 FUGW-FL (Tlr5+/+) でチャレンジし、前の実験と同様に処理しました (補足表 4)。 2つの独立した実験からのカプラン・マイヤー生存曲線を図2dに示します。ビヒクル制御下のすべてのマウスは研究の終わりまでに死亡した（補足図6a、e）。ただし、Tlr5-/- ビヒクルコントロールマウス (n = 7) の生存曲線が、Tlr5+/+ ビヒクルコントロールマウス (n = 7) の生存曲線に対して有意な差を示したことは注目に値します (p = 0.03、ログランク)テスト; p = 0.03、Gehan-Breslow-Wilcoxon テスト) (図 2d)。両方のコホートグループのICTまたはCBLB502処置マウスはすべて6週目までに死亡した（補足図6b、c、f、およびg）。以前の結果（図2b）と一致して、CBLB502（低用量）+ ICT治療で治療したTlr5+/+マウスは、20％の腫瘍のないマウス（n = 10）をもたらしました（図2dおよび補足図6d、マウス2および4)。一方、CBLB502 (低用量) + ICT 治療で治療されたすべての Tlr5-/- マウスは研究終了までに死亡しました (n = 10) (p = 0.001、ログランク検定; p = 0.01、Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定) 、CBLB502（低用量）+ ICT治療で治療したTlr5+/+マウスと比較）（図2dおよび補足図6h）。これらの結果は、TLR5 宿主受容体が、CBLB502 および ICT 治療で治療されたマウスで観察される抗腫瘍応答に必要であることを示しています。

完全な腫瘍退縮を示したマウスには、追加治療を行わずに、反対側（左側）の第4乳房脂肪体に4T1 FUGW-FL細胞を同所注射して再チャレンジした（補足表5）。図 3a は、再攻撃実験による全生存率を示しています。未治療の腫瘍ナイーブマウス、腫瘍担持マウス、および年齢が一致した対照マウスはすべて6週目までに死亡し、腫瘍細胞コホートの悪性度の潜在能力が確認されましたが、再攻撃マウスの80％は腫瘍後少なくとも60週間は腫瘍がありませんでした。移植（図 3a ～ c）。死因は腫瘍移植とは無関係であったため、再攻撃を受けた1匹のマウスは図3aに示す生存曲線から除外されました（補足図2e – ビヒクル、マウス20は3週目にサイトカインプロファイリングのための採血中に死亡しました）。さらに、再チャレンジの 1 週間後、このマウスは他の再チャレンジマウスと同等の生物発光シグナルを示し (補足図 7)、これは腫瘍移植の成功を示しています。しかし、その後の実験の最初の 3 週間では生物発光シグナルや触知できる腫瘍は検出されず、マウスが 4T1 FUGW-FL 腫瘍移植を拒否した可能性が高いことを示しています。それにもかかわらず、全体として、これらの結果は、観察された治療効果が抗腫瘍免疫についての獲得された記憶によるものである可能性が高いことを示した。

4T1 FUGW-FL腫瘍移植後少なくとも18週間生存し、腫瘍の兆候を示さなかったが、対側に同所性4T1 FUGW-FL腫瘍細胞を再投与したBALB/cマウスのカプラン・マイヤー生存分析（左） 4 番目の乳腺脂肪体 (n = 15) と年齢を一致させた対照の腫瘍ナイーブマウス (n = 14)。すべてのマウスに 0 週目に 4T1 FUGW-FL 腫瘍細胞を注射し、治療介入なしで腫瘍を増殖させました。再チャレンジマウスは80％の生存率を示した（p = 0.0001、ログランク検定; p = 0.0001 Gehan-Breslow-Wilcoxon）。 b 生物発光イメージング（総光子束、左パネル）およびキャリパー測定（腫瘍体積、右パネル）によって測定された、腫瘍ナイーブマウス（n = 14）の腫瘍サイズ。腫瘍未処理の腫瘍チャレンジマウスはすべて、6週目までに死亡した。 c 生物発光イメージング（全光子束、左パネル）およびカリパス測定（腫瘍体積、右パネル）によって測定された、再チャレンジマウス（n = 15）の腫瘍サイズ。腫瘍量により死亡した腫瘍生存マウスは 3 匹のみでした：補足図 2f-マウス 23 (ICT)、補足図 2h-マウス 1 (CBLB502 1 μg (it) + ICT)、および補足図 3d-マウス 5 (CBLB502) 10 μg (it))、および (補足表 5)。他のすべての腫瘍生存マウスは、同所性腫瘍の再攻撃後少なくとも 60 週間腫瘍が存在しませんでした。

反応メカニズムの理解を深め、ICT および CBLB502 療法の単独または組み合わせによって引き起こされる変化を特徴付けるために、年齢を一致させた腫瘍のないマウス (健康なマウス、腫瘍移植なし) および 4T1 からの 32 の末梢血由来のサイトカインを分析しました。我々の治療コホート下のFUGW-FL腫瘍担持マウス：腫瘍担持マウス、ビヒクル対照。腫瘍を抱えている、治療が失敗している。 4T1 FUGW-FL 腫瘍の 3 週目（図 4a）および 10 週目（補足図 8f）および 5 週目から 7 週目（図 4c）の間の、腫瘍を有する治療反応者（補足図 8a ～ e）。マウスを産むコホートのみ。注目すべきことに、腫瘍のない健康なマウスは、研究の3週間から10週間の間でサイトカインのさまざまな発現を示し、これはサイトカイン発現の生理学的変化を反映している可能性があります（図4aおよび補足図8f、腫瘍のないマウス）。

腫瘍のないマウスと、同所性腫瘍移植後3週間で4T1 FUGW-FL腫瘍をチャレンジしたマウスの32の末梢血サイトカインのヒートマップ：腫瘍のないマウス（健康なマウス、腫瘍は移植されていない）。腫瘍担持マウス、ビヒクル（PBS）対照（非生存者）、腫瘍担持マウス、治療失敗（非生存者）、および腫瘍担持マウス、長期生存者。 b 同所性腫瘍攻撃から 3 週間後の末梢血サイトカイン間の検出可能な統計的差異を強調する火山プロット。 c 腫瘍移植後5〜7週間の4T1 FUGW-FL腫瘍をチャレンジしたマウスの32の末梢血サイトカインのヒートマップ：5週目の腫瘍担持マウス、ビヒクル（PBS）対照（非生存動物）。腫瘍担持マウス、治療失敗（非生存マウス）、5～7週目。 d 同所性腫瘍チャレンジ後 5 週間と 7 週間の間に採取された末梢血サイトカイン間の検出可能な統計的差異を強調する火山プロット。 e 4T1 FUGW-FL腫瘍を再攻撃したマウスの32の末梢血サイトカインのヒートマップ：腫瘍ナイーブマウス、腫瘍担持マウス（非生存マウス）、腫瘍生存マウス、再攻撃失敗マウス（非生存マウス）および腫瘍生存マウス、同所性4T1 FUGW-FL腫瘍移植後3週間で撮影された再チャレンジ生存者（長期生存者）。 f 同所性腫瘍の再攻撃から 3 週間後に採取された末梢血由来のサイトカイン間の検出可能な統計的差異を強調する火山プロット。

私たちの分析から 4 つのプロファイルが明らかになりました。まず、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF) のレベルが顆粒球と好中球の増殖と分化に関与するサイトカインであり 58、子宮頸がん、非小細胞肺がん、結腸がん、黒色腫の生存率低下と関連していることは注目に値します。および皮膚がん59、60、61、62、63は、4T1-FUGW-FL腫瘍移植後3週間で、腫瘍のないマウスと比較して、担癌マウス、ビヒクル対照の統計的増加を示した（図4a、b、左パネル、補足表6）、および腫瘍担持マウス、治療反応者（長期生存者）と比較した場合の統計的減少（図4a、b、中央パネル、補足表6）。治療に失敗した腫瘍担持マウス（非生存マウス）と、4T1 FUGW-FL腫瘍移植後3週間の治療反応マウス（長期生存マウス）との間に統計的な差はありませんでした（図4a、b、図4a、b、右パネル、補足表 6)、これら 2 つのマウスグループ間で 5 週目から 7 週目にかけて統計的減少が見られました (図 4c、d、右パネル、補足表 7)。これらの結果と一致して、腫瘍担持マウス、治療応答者も、担癌マウス、ビヒクル対照と比較した場合、5週目から7週目までに統計的減少を示した（図4c、d、中央パネル、補足表7）。第二に、腫瘍微小環境への骨髄由来サプレッサー細胞（MDSC）の動員に関与し64、65、66、67、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、および子宮頸がんの生存率の低下に関連するケモカインであるCXCL5は、腫瘍の統計的減少を示しました。 4T1 FUGW-FL腫瘍移植後3週間で治療に反応した担癌マウス（長期生存マウス）と、治療に失敗した担癌マウス（非生存マウス）を比較した（図4a、b、右パネル、補足表6）。第三に、腫瘍移植後 5 週間から 7 週間の間に、ナチュラルキラー (NK)、CD8+ T 細胞、および B 細胞の生存、分化、増殖、および活性化を促進する炎症促進性および免疫活性化サイトカインである IL-15 が、細胞69、70、71、72、73、74、75は、治療に反応しなかった腫瘍担持マウス（非生存マウス）と比較して、治療に反応した腫瘍担持マウス（長期生存マウス）の統計的増加を示した（図1）。 4c、d、右パネル、補足表7）または腫瘍担持マウスビヒクル対照を使用した場合（図4c、d、中央パネル、補足表7）。対照的に、治療に失敗した腫瘍担持マウス（非生存者）と比較して、腫瘍担持マウス、ビヒクル対照の間に統計的差異はなかった（図４ｃ、ｄ、左パネル、補足表７）。第 4 に、二元配置 ANOVA 検定に基づく統計的有意性ではありませんが、治療に反応した担癌マウスは、腫瘍移植後 5 週間から 7 週間の間に、治療に失敗した担癌マウスと比較して、免疫活性化サイトカインの全体的な増加傾向を示しました。 GM-CSF (11 倍)76、IL-2 (15 倍)77、IL-13 (8 倍)78、IFN-γ (7 倍)79、および CCL3 (4 倍)80。注目すべきことに、腫瘍免疫抑制に関連するケモカイン81であるCXCL1は、治療が失敗した腫瘍担持マウスと比較して4倍の増加を示した(補足表7)。抗原提示細胞 (APC) の阻害と免疫抑制 T-reg 細胞の活性化による免疫抑制に関与するサイトカインである IL-10 は 82、治療に反応したマウスでは治療に失敗したマウスと比較して 2 分の 1 の減少を示しました (補足表7)。興味深いことに、IL-10 アンタゴニストは、TLR アゴニストや他の免疫刺激治療と組み合わせた抗腫瘍免疫療法として現在研究されています 83。最後に、治療に反応した腫瘍担持マウス（長期生存マウス）は、腫瘍のない対照マウスと比較して、IL-1α、IL-15、CXCL5、および IL-12 p40 の統計的増加を示し、全身性の特有の免疫活性化を示しました。 4T1 FUGW-FL腫瘍移植後10週間のサイトカインプロファイル（補足図8f、g）。

腫瘍を再攻撃したマウスおよび腫瘍ナイーブマウスのサイトカインを、4T1 FUGW-FL 移植の 3 週間後にアッセイしました。再攻撃後少なくとも 60 週間腫瘍が存在しなかったマウス (腫瘍生存マウス、再攻撃生存) は、再攻撃されたものの腫瘍が発生したマウス (腫瘍生存マウス、再攻撃生存) とは異なるサイトカインプロファイルを明らかにしました。失敗）（図4a）。興味深いことに、チャレンジマウスでの以前の結果（図4c、d）と同様に、IL-15は、再チャレンジされたマウスと比較して、長期生存マウス（腫瘍生存マウス、再チャレンジ生存マウス）の統計的増加を示しましたが、そうではありませんでした。生存しなかった（腫瘍生存マウス、再チャレンジ失敗）（図4e、f、右パネル、補足表8）および同様に生存しなかった腫瘍未処置の腫瘍担持マウス（図4e、f、中央パネル、補足表8）表8）。興味深いことに、生存しなかった再チャレンジマウス（腫瘍生存マウス、再チャレンジ失敗）も、腫瘍ナイーブマウス、腫瘍を有するマウスと比較した場合、統計的増加を示しました（図4e、f、左パネル、補足表8）。長期生存マウス（腫瘍生存マウス、再攻撃生存マウス）よりも程度は低い。さらに、G-CSFのレベルも、腫瘍ナイーブマウス、腫瘍担持マウス（非生存者）と比較した場合、長期生存者（腫瘍生存マウス、再攻撃生存者）では低下する傾向があった（補足表）。 8) しかし、これらの値は統計的有意性には程遠いものでした (二元配置分散分析)。再チャレンジされたが生き残れなかったマウス（腫瘍生存マウス、再チャレンジ失敗）は、この時点で腫瘍ナイーブマウス、腫瘍担持マウスと同様のレベルのG-CSFを示しました（補足表8）。さらに、分析から 4 つのプロファイルが明らかになりました。まず、再チャレンジ失敗マウスと再チャレンジ生存マウスの両方でアップレギュレートされたサイトカインですが、再チャレンジ生存マウスでははるかに大きく増加しました：LIF（420倍と比較して5倍）、CXCL1（420倍と比較して3倍） 120倍）、IL-2（260倍と比較して7倍）、IL-7（3700倍と比較して100倍）、IL-12 p70（240倍と比較して10倍）、CCL4 (58 倍と比較して 3 倍)、CCL11 (27 倍と比較して 3 倍)、CCL3 (20 倍と比較して 3 倍)、IL-1α (22 倍と比較して 4 倍)、IL -10（210倍と比較して55倍）、IL-1β（6倍と比較して3倍）、CXCL2（17倍と比較して8倍）、IL-4（41倍と比較して21倍）倍）、IL-9（7倍と比較して4倍）、およびM-CSF（62倍と比較して40倍）（補足表8）。第二に、両方のグループでダウンレギュレートされたが、再チャレンジ失敗コホートではより大幅にダウンレギュレートされたサイトカイン：IL-3 (0.7 減少と比較して 0.4)、IL-5 (0.5 減少と比較して 0.3)、および CXCL10 (0.3 と比較して 0.3) 0.5 減少）（補足表 8）。第三に、2 つのコホート間で異なる制御を示したサイトカイン:IL-12 p40 (2 倍増加と比較して 0.4 減少)、TNFα (2 倍増加と比較して 0.5 減少)、IL-6 (2 倍増加と比較して 0.7 減少)。倍増加）（補足表8）。第 4 に、ある集団では変化しなかったが、別の集団では変化したサイトカイン: 再攻撃生存マウスは、IL-13 (53 倍)、CXCL9 (12 倍)、IFN-γ (9 倍)、CCL5 (3 倍) を上方制御しました。 -倍)、一方、再攻撃失敗マウスはこれらのサイトカインを 2 倍を超えて上方制御しませんでした。 CXCL5 は、長期生存マウスでは 0.8 の減少を示しましたが、生存できなかったマウスでは変化がありませんでした。 IL-17は、生存できなかったマウスでは2倍の増加を示しましたが、長期生存マウスでは変化がありませんでした(補足表8)。総合すると、これらの結果は、再攻撃実験で生き残ったマウスにおける独特の適応免疫活性化サイトカインプロファイルを示しました。

CBLB502 療法と ICT 療法の単独または併用の効果をさらに解明するために、これらの療法に反応した腫瘍免疫微小環境の変化を調査し、免疫細胞浸潤の変化が生存可能性の増加と相関するかどうかを調べました。我々は、腫瘍摘出およびその後の腫瘍免疫浸潤フローサイトメトリープロファイリングのために4T1 FUGW-FL腫瘍移植後3週間で安楽死させたマウスの生存転帰の予後予測ツールとして、生物発光シグナルに基づく独自の戦略を使用した。これは転帰前の時点で有効であった。個々のマウスのシグナルは既知ですが、生物発光シグナルは予測に役立ちます。

腫瘍体積と BLI の測定は、前臨床モデルで腫瘍の進行を評価するための有用なツールです 84、85、86、87。さらに、BLI 測定は、さまざまな動物モデルでの治療効果を評価するために使用されています 88,89。したがって、全生存データと腫瘍進行測定（図2a、b、および補足図2）を活用して、4T1 FUGWの3週間後の生物発光（総光子束）および/または腫瘍体積測定の生存結果の予測可能性を評価しました。 -FL腫瘍移植。受信者動作特性（ROC）曲線の曲線下面積（AUC）を使用して、各測定値の全体的な診断精度を決定し、12 週間までの生存に基づいてデータセットを「生存者」と「非生存者」に二分しました90。図 5a は、BLI (3 週目の Log10 総光子束) が最良の予測値 (AUC = 0.75; 95% CI 0.6 ～ 0.9; p ≤ 0.001) で、それに僅差で腫瘍サイズ (AUC = 0.74、95% CI 0.6 ～ 0.001) が続いたことを示しています。 0.9; p ≤ 0.001) (図 5b)。 2〜3週目の腫瘍体積の傾きも定量化因子として利用されましたが、有意差には達しませんでした（AUC = 0.6、95％CI 0.5〜0.7、p ≥ 2）（図5c）。また、Log BLI と腫瘍量の間に相関関係はほとんどなく、各測定によって追加情報が提供される可能性があることが示唆されました。生存転帰に関する BLI 測定の予測診断精度は、BLI 測定値が高いマウスは生存の可能性が低下し、BLI 測定値が低いマウスは生存の可能性が高いことを示しました。

ROC 曲線は、3 週目の生物発光 (全光子束)、b 3 週目の腫瘍体積、c 2 週目と 3 週目の腫瘍体積の傾きによる全生存期間の感度と特異性を比較しています。 d 腫瘍免疫に使用される安楽死マウスの治療図プロファイリング。

次に、3週間後の治療に応じた腫瘍免疫微小環境の変化を調べました。 4T1 FUGW-FL 腫瘍担持マウスを CBLB502 または ICT を単独または組み合わせて 1 週間治療し、図 5d、スキーム、および補足表 9 に示すように、腫瘍採取のために腫瘍移植の 3 週間後に安楽死させました。腫瘍は酵素的に消化され、調製されました。骨髄細胞: 樹状細胞、単球 (Ly6C+)、単球 (Ly6C+、Ly6G+)、マクロファージ、M1 様マクロファージ、および M2 様マクロファージ、またはリンパ系細胞: B 細胞、NK 細胞のいずれかを標的とする抗体で染色することによるフローサイトメトリー分析用CD3+ T 細胞、CD8+ T 細胞、CD4+ T 細胞、および T regs 細胞 (補足表 10、11)。骨髄系細胞とリンパ系細胞は、補足表 12 に記載されているように同定されました。

4T1腫瘍の以前の観察と一致して、91、92骨髄細胞（CD11b+細胞）は、ビヒクルコントロールマウスから採取された腫瘍サンプルに存在する免疫細胞（CD45+細胞）の大部分を構成しました（補足図9;骨髄細胞パネル、ビヒクルコントロール）。しかし、治療マウスから採取した腫瘍サンプルは、骨髄細胞数の変動が増加する傾向を示しました（補足図9;骨髄細胞パネル、治療対照）。この傾向は、治療を受けたマウスで進行中の免疫反応を反映している可能性があります。実際、治療を受けたマウスにおける腫瘍免疫状況の全体的な変化は不均一であり、免疫活性化を示している可能性があります。

まず、単球（Ly6C+）と単球（Ly6C+、Ly6G+）の割合の増加がBLIシグナルの増加と相関していることを観察しました（r = 0.6、p < 0.001およびr = 0.7、p < 0.001）（図6a、b）、濃い紫色と茶色の矢印）。さらに、骨髄細胞、樹状細胞、M1 様マクロファージ、T reg、および NK 細胞の割合の増加も、統計的有意性には達しませんでしたが、BLI シグナルの増加と相関していました (r = 0.4、p > 0.08; r = 0.3、それぞれ、p > 0.08; r = 0.2、p > 0.4; r = 0.01、p > 0.9; r = 0.2、p > 0.4）（図6a、b）。 BLI シグナルが増加した担癌マウスにおける Ly6C+ および Ly6C+、Ly6G+ 単球の数の増加は注目に値します。 4T1 腫瘍は、低分化骨髄細胞の不均一集団である単球性 MDSC の強力な誘導因子であることが知られています 93,94。 MDSC は、腫瘍細胞、マスト細胞、マクロファージ間のクロストークを制御することにより、T 細胞の活性化と増殖を抑制し、ナチュラルキラー (NK) 細胞の機能を損ない、免疫抑制 T reg 細胞を誘導し、前腫瘍炎症状態を促進することが知られています 95。これらの結果と一致して、CD3 + T細胞およびCD4 + T細胞の割合の増加がBLIシグナルの増加と逆相関していることがわかりました（r = −0.6; p ≤ 0.01およびr = −0.5; p ≤ 0.01）（図6a、b、緑色）と薄紫色の矢印）。さらに、CD8+ T 細胞、B 細胞、マクロファージ、および M2 様マクロファージの増加は、BLI シグナルの増加と逆相関を示しましたが、相関関係は統計的有意性には達しませんでした（r = −0.3; p > 0.3、r = −0.3;それぞれ、p > 0.2、r = −0.06、p > 0.9、r = −0.4、p > 0.8）（図6a、b）。全体として、これらの結果は、BLI シグナルが低下したマウスにおいて、腫瘍免疫微小環境の状態が免疫抑制から免疫活性化に切り替わり、その後の治癒的な抗腫瘍反応が誘発されることを示しています。

ビヒクルマウスおよび処置マウスの骨髄系（上のパネル）およびリンパ系（下のパネル）腫瘍免疫浸潤プロファイル。4T1 FUGW-FL腫瘍移植後3週間および腫瘍摘出前に取得したLog BLI測定値を割り当てた。 b 免疫浸潤とLog BLIの間の相関関係を強調する火山プロット。垂直線は、負のスピアマン r 相関値と正のスピアマン r 相関値を示します。同一性の線は p = 0.05 を示します。パネル A および B では、緑、薄紫、茶色、濃い紫の矢印がそれぞれ CD3+ T 細胞、CD4+ T 細胞、単球 (Ly6C+、Ly6G+)、および単球 (Ly6C+) を強調表示しています。

最後に、長期生存マウスの血液由来サイトカインプロファイル（図4a、b）と免疫プロファイルマウス（補足図8a〜eおよび補足図8a〜e）を比較することにより、Log（BLI）シグナルの診断可能性を裏付けることをさらに追求しました。表 13 ～ 16)。長期生存マウスの末梢血サイトカインプロファイルと一致して、Log（BLI）シグナルが低い安楽死マウスはG-CSFの減少と相関しました（r = -0.8; p ≤ 0.001）（補足図10a、b）。注目すべきことに、以前に生存に有害であると特定されたCXCL5（図4b）は、統計的に有意な差を示さなかった：（r = -0.2; p > 0.5）（補足図10a、b）。ただし、サンプルサイズによって統計的な差異を検出する能力が制限されている可能性があります。

4T1 乳がんは、浸潤性、転移性が高く、免疫チェックポイント療法に抵抗性であるヒトのトリプルネガティブ乳がんを研究するための堅牢なマウスモデルです96,97。ここで我々は以下を報告する：(1) 標準的な ICT と強力な自然免疫活性化 TLR5 アゴニストの組み合わせによる、確立された ICT 抵抗性マウス 4T1 乳癌および免疫原性が低く ICT 抵抗性の B16-F10 黒色腫腫瘍モデルの治療の成功、(2)宿主TLR5受容体は、4T1腫瘍担持マウスにおいてICTとTLR5アゴニストの組み合わせで治療されたマウスの生存率を高めるために必要である、(3)免疫関連治療は、ほとんどの長期生存マウスにおいて腫瘍抗原に対する免疫記憶を誘発した、(4)全身性サイトカインこれらのプロファイルは、治療に応じた自然免疫と適応免疫の両方の関与を示唆しており、(5) CXCL5 と G-CSF は治療に対する陽性反応のバイオマーカーとして機能している可能性があり、(6) IL-15 は、免疫反応の誘発における適応免疫の関与を示している。治癒的な抗腫瘍反応、(7) 3 週目での腫瘍進行の中間点バイオマーカーとして非侵襲性 BLI シグナルを活用した新しいアプローチは、7 週目以降の生存転帰の予測ツールとして機能し、その後、生存確率の増加と最もよく相関する個々のマウスにおける中間点の腫瘍免疫微小環境の変化を特定し、(8) CD3 + T 細胞および CD4 の増加を伴う単球 (Ly6C+) および単球 (Ly6C+、Ly6G+) の減少+ T 細胞は、腫瘍微小環境状態を免疫抑制から免疫活性化に導いた可能性があります。実際、細菌フラジェリンは TLR5 の天然リガンドであるため、全体として、我々の研究は ICT 応答と微生物叢の間の関連性についてのさらなる機構的洞察を提供します 98,99,100,101。

総合すると、これらの結果は、免疫系の先天的要素と適応的要素の両方を利用して持続的な抗腫瘍反応を引き出す新しい治療戦略を示しています。一方で、細菌由来のフラジェリンは、TLR5に結合し、転写因子NF-kB32の活性化を介して炎症誘発性反応を引き起こすシグナルのカスケードを開始することにより、標的とした抗腫瘍反応を誘発することが示されています。本明細書において、我々は、NF-κBシグナル伝達経路の強力な活性化因子であるCBLB502が、腫瘍細胞においてTLR5媒介免疫原性サイトカイン応答を誘発するのに十分であることを、in vitroで初めて示した。抗原提示の欠陥が ICT に対する耐性の多くのメカニズムの根底にあることを考えると、自然免疫の強力な活性化因子が腫瘍の恒常性を調節し、腫瘍微小環境の状態を免疫抑制から免疫活性化に移行させる可能性があると仮説を立てることが可能です (図 7)。いくつかの証拠がこのモデルを裏付けています。まず、鞭毛またはCBLB502とICTを組み合わせた治療のみが、高度にICT難治性の4T1腫瘍およびB16-F10腫瘍を有するマウスの生存率を延長させたが、フラジェリン、CBLB502、またはICTの単独療法では有意な治癒効果は示されなかった。第二に、治療に反応し、完全な腫瘍退縮を示した 4T1 腫瘍担持マウスの末梢血サイトカインプロファイルは、協調的な抗腫瘍反応を反映していました。第三に、Tlr5-/- マウスは、ICT と TLR5 アゴニストを含む併用療法に応答できなかった。このことは、生存率の向上には宿主の TLR5 受容体が必要であることを示している。 TLR5を欠く腫瘍細胞を有するマウスはフラジェリン26による治療に反応しないことが示されているが、鞭毛とCBLB502が腫瘍細胞に作用して、ICTとの併用治療において治癒免疫応答を誘発できるかどうかについてはまだ研究されていない。。さらに、宿主の TLR5 受容体が主に自然免疫軸の構成要素に作用するのか、それとも ICT の状況において持続的な免疫応答を誘発するために獲得免疫の構成要素にも直接作用するのかどうかはまだ解明されていない。第 4 に、再攻撃を受けたほぼすべての生存マウスが同じ腫瘍を拒絶したことは、腫瘍細胞に対する適応記憶反応を示唆しています。第五に、腫瘍を再チャレンジして拒絶したマウスの末梢サイトカインプロファイルは、強力な適応免疫活性化反応と一致しました。最後に、生存の可能性が増加したマウスの腫瘍免疫浸潤の変化は、治癒的な抗腫瘍反応につながる免疫活性と一致していました。

4T1 FUGW-FLを移植されたBALB/cマウスの腫瘍微小環境には、前腫瘍微小環境に有利な免疫抑制細胞が高度に浸潤しています（左パネル）。 TLR5 アゴニストと PD-1 および CTLA-4 を標的とする ICT 治療を組み合わせて自然免疫を強力に活性化すると、免疫活性化サイトカイン IL-15 が全身的に増加し、免疫抑制サイトカイン G-CSF および CXCL5 が減少します。同時に、単球 (Ly6C+) および単球 (Ly6C+、Ly6G+) の減少と、CD3+ T 細胞および CD4+ T 細胞の増加が伴い、免疫活性化と抗腫瘍反応が引き起こされます (右パネル)。

治療に失敗したか、または腫瘍を有する未治療対照として機能した腫瘍を有するマウスにおける血液由来のG-CSFタンパク質レベルの顕著な増加は、G-CSFが潜在的なバイオマーカーとして研究される可能性があることを示唆した。逆に、治療に反応した、または長期の腫瘍免疫を発現した担癌マウスの血清G-CSFレベルが低いことは、治療反応の予測マーカーとしての有用性を示唆した。これらの結果は、がん患者の好中球減少症を予防するための G-CSF の使用に対する警戒をさらに高めています。最近のメタアナリシス研究では、化学療法を受けている患者の全生存期間において支持的 G-CSF 療法がある程度の利益をもたらすことが示されましたが、データは二次悪性腫瘍を発症するリスクの増加も示しています 102。 ICT の文脈における G-CSF 療法はまだ研究されていません。同様に、長期生存マウスは治療に失敗したマウス（非生存マウス）と比較して統計的に有意なCXCL5の減少を示したことは注目に値し、CXCL5が治療反応のバイオマーカーおよび/または潜在的な治療標的としても研究される可能性があることを示しています。

結論として、免疫チェックポイント療法が、一部の患者においてさまざまなタイプのがんに対する長期にわたる治癒反応を引き出すことに成功したことは、このタイプの治療に反応する患者の数を拡大するための価値のある努力となる。フラジェリンやCBLB502などのTLR5活性化剤とICTの組み合わせは、これまで反応がなかった患者に新たな治療の機会を提供する可能性がある。

ネズミチフス菌フラジェリン (FLA-ST) は Invivogen から購入しました。 CBLB502 は Cleveland Biolabs, Inc. から寄贈されました。モノクローナル抗体 9D9 (抗 CTLA-4) および RPM1-14 (抗 PD-1) は BioX Cell から購入し、それぞれ 6.5 および 6.7 mg/mL ストックで維持しました。使用前は 4 °C で保管してください。ホタルルシフェラーゼの基質である d-ルシフェリン (d-Luc) (BioGold) は、30 mg/mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液中に維持されました。マトリゲルは Corning から入手し、-20 °C に維持しました。

95％コンフルエントの4T1乳癌細胞（ATCC）を、10cmディッシュ（BD Bioscience）中でFugene 6（Roche）を使用して、10μgのpκB5:IκBα-FLuc52および3μgのpIRES-puroプラスミドDNAで同時トランスフェクトした。培養物を 37 °C でインキュベートし、24 時間後に培地を 10% 熱不活化 FBS を補充した新鮮な RPMI と交換しました。 24 時間後、安定した形質転換体を選択するために、細胞を複数の希釈率で 0.5 μg/ml ピューロマイシンを含む培地に分割しました。 2 週間後、単離された細胞コロニーを画像化してレポーター遺伝子の発現を確認し、生物発光コロニーを収集して増殖させました。レポーター細胞は、レポータープラスミドの発現を維持するために、0.5 μg/ml ピューロマイシンの存在下で継続的に培養されました。

構成的蛍光および生物発光デュアルイメージングレポーター細胞（FUGW-FL）を産生するEF1α:FLucプラスミドを安定にトランスフェクトした4T1乳癌レポーター細胞FUGW103をATCCプロトコールに従って培養し、0.5μg/mlピューロマイシン104による選択下に維持した。 B16-F10 親細胞は ATCC プロトコールに従って培養されました 105。

4T1 κB5:IκBα-FLuc レポーター細胞 (7000 細胞) を 96 ウェルプレートに添加し、37 °C で一晩インキュベートしました。イメージングの 1 時間前に、細胞培地を吸引し、10% 熱不活化 FBS および 150 μg/ml d-ルシフェリン (BioGold) を補充した L-グルタミン酸を含む RPMI (4T1 細胞) に置き換えました。細胞はIVIS 100イメージングシステムで画像化され、特に指示がない限り、画像は5分ごとに4時間取得されました。細胞は、加熱ステージ (37 °C) と 5% CO2 空気流によってイメージングチャンバー内に維持されました。取得パラメータは次のとおりです。取得時間は 60 秒です。ビニング、4 ～ 8。フィルター、開いています。 f 停止、1; 視野、12 ～ 23 cm。含まれる刺激物: TNFα (20 ng/ml) (R&D システム)。フラジェリン (1 μg/mL ～ 0.1 ng/mL の範囲のさまざまな濃度); CBLB502 (1 μg/mL ～ 0.1 ng/mL の範囲のさまざまな濃度); およびヌクレアーゼフリー水（ベクターのみの対照）を３つのウェルに添加した。生物発光光子束データ (光子/秒) は、示された数の独立した実験に対する 3 つのウェルの平均を表し、Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences) による関心領域 (ROI) 測定によって分析されました。データは Excel (Microsoft Corp.) にインポートされ、平均化され、動的プロットで表示するために初期 (t = 0) 値 (初期倍数) とビヒクル処理対照 (ビヒクル倍数) の両方に正規化されました 50。繰り返された実験からの正規化された結果は各時点で平均され、結果は正規化された光子束対時間としてグラフ化され、y 軸は log2 スケールで表示されました。正の誤差バーは、反復実験の平均の標準誤差を表します。

すべての動物手順は、テキサス大学 MD アンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。プロトコル00001179-RN01。メスの BALB/c マウス (4 週齢) を The Jackson Laboratory から購入しました。 BALB/c Tlr5-/- マウスの交配ペアは、韓国の全南国立大学医学部の Joon Haeng Rhee から寄贈されました 106。 BALB/c Tlr5-/- は、テキサス大学 MD アンダーソンがんセンターの獣医学部および外科によって飼育および維持されました。メスの C57BL/6J (生後 6 ～ 9 週齢) を The Jackson Laboratory から購入しました。実験を開始する前に、動物を動物施設に順応させるために少なくとも 1 週間放置した。

テキサス大学 MD アンダーソンがんセンター IACUC 安楽死プロトコルに従って、終点に達したマウス (瀕死の状態、または矢状面または軸面で 1.5 cm を超える腫瘍測定値が 1 つある) を安楽死させました。

乳細胞癌同種移植片は、マトリゲルと 2:1 の比率で混合した約 10,000 個の 4T1 FUGW-FL 細胞を第 4 乳房脂肪体に同所注射することにより、BALB/c マウス (5 ～ 6 週齢マウス) に確立されました。各マウスに注射された総量は30μLであった。

フラジェリン、CBLB502、9D9 (抗 CTLA-4)、および RPM1-14 (抗 PD-1) を濾過した PBS に懸濁しました。濾過したPBSをビヒクル対照として使用した。乳房脂肪体への 4T1 FUGW-FL 細胞の同所性注射の 2 週間後、各マウスをビヒクル対照群 (n = 45、合計)、またはフラジェリンのみ (n = 22)、CBLB502 のみ (n = 22) による治療を受けるグループにランダムに分類しました。 = 30)、ICT のみ (9D9 プラス RPM1-14) (n = 37)、フラジェリンと ICT の組み合わせ、または CBLB502 と ICT の組み合わせ (n = 52)。フラジェリンまたは CBLB502 を 2 週間にわたって 2 日ごとに投与しました。異なる治療グループに分類されたすべてのマウスは、4T1 FUGW-FL腫瘍細胞移植後1週目と2週目に検出可能なレベルの生物発光シグナルを示し、治療開始前に腫瘍の存在が確認されました（補足図2、3b〜e、4b〜）。 e、6、および 8b ～ e)。治療初日に、50 μL (PBS) 中のフラジェリン溶液 10 μg、または 50 μL (PBS) 中の CBLB502 溶液 10 μg (高用量) または 1 μg (低用量) を腫瘍内または指定動物への腹腔内注射。後続の各処理では、50 μL (PBS) 中の2 μg のフラジェリン溶液、または 50 μL (PBS) 中の 2 μg (高用量) または 200 ng (低用量) の CBLB502 溶液を使用しました。 ICTは治療の1日目、3日目、5日目、および8日目に投与されました。初日に、ＩＣＴ治療を受けるマウスに、９Ｄ９およびＲＰＭ１－１４の両方１００μＬ中２００μｇを腹腔内注射した（マウス１匹あたり合計２００μＬ）。翌日、各マウスに、100μL中の各抗体100μgを注射した。フラジェリンとＩＣＴの両方を投与した日に、ビヒクル対照マウスに１００μＬのＰＢＳを２回腹腔内注射するか、２００μＬのＰＢＳを１回腹腔内注射し、５０μＬのＰＢＳを１回腫瘍内注射した。フラジェリンのみを投与した日には、ビヒクルマウスには５０μＬのＰＢＳ腫瘍内注射のみを与え、ＩＣＴのみを投与した日には、１００μＬのＰＢＳを２回腹腔内注射するか、２００μＬのＰＢＳを１回腹腔内注射するだけとした。

マウスは、乳房脂肪体への 4T1 FUGW-FL 細胞の同所性注射の 1 週間後から毎週、PerkinElmer IVIS Spectrum Imaging System を使用して画像化されました。各イメージングセッションの開始時にマウスの体重を測定し、マウス１グラム当たり１６５μｇのｄ－ルシフェリン（ＰＢＳ中３０ｍｇ／ｍＬで調製）を腹腔内注射した。 d-ルシフェリン50を注射してから10分後にマウスを画像化した。

Tlr5+/+ および Tlr5-/- マウスからのゲノム DNA は、マウスから 3 mm 未満の尾端を切り取ることによって得られました。 DirectPCR Lysis Reagent Tail (Viagen Biotech Inc) を使用して尾サンプルを処理し、その後 PCR を行いました (補足図 11a、b)。 Tlr5 遺伝子を含むゲノム領域は、以下のプライマーと PCR プロトコールを使用して増幅されました。

Tlr5-WT: 5'-CTA TCT GGC AAC CAG ATT CAC AGC CTC-3'

Tlr5-KO: 5'-CTA AAG CGC ATG CTC CAG ACT GCC TTG-3'

Tlr5-extra: 5'-CAG GTC GTT AAA TAT CCC AGG TGG AAG-3'

初期変性、94 °C 5 分間。変性、94 °C 1 分間。アニーリング、62 °C で 1 分間。伸長、72 °C 1 分間、30 サイクル、その後最終伸長、72 °C 5 分間。

約 12,000 個の B16-F10 細胞を右背側腹部に皮下注射することにより、C57BL/6J マウス (ジャクソン研究所、生後 6 ～ 9 週齢のマウス) に黒色腫腫瘍が確立されました。各マウスに注射した総量は、Ｌ－グルタミン培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した５０μＬの細胞であった。

右脇腹後部へのB16-F10細胞の皮下注射から3日後、各マウスを、ビヒクル対照、CBLB502のみ、ICTのみ（9D9プラスRPM1-14）、またはCBLB502とICTを組み合わせた治療を受けるグループにランダムに分類した。 CBLB502、9D9、およびRPM1-14を濾過したPBSに懸濁し、濾過したPBSをビヒクル対照として使用した。 CBLB502 を 2 週間にわたり 2 日おきに投与しました。治療の初日に、50μL中1μgのCBLB502を指定動物に腫瘍内注射として投与した。以降の各処理には、50 μL 中の 200 ng の CBLB502 を使用しました。 ICTは治療の1日目、3日目、5日目、および8日目に投与されました。初日に、ＩＣＴ治療を受けるマウスに、９Ｄ９およびＲＰＭ１－１４の両方１００μＬ中２００μｇを腹腔内注射した（マウス１匹あたり合計２００μＬ）。その後の治療日に、各マウスに各抗体 100 μL 中の 100 μg を注射しました。 CBLB502とICTの両方を投与した日に、ビヒクル対照マウスに200μLのPBSを腹腔内注射し、50μLのPBSを1回腫瘍内注射した。 CBLB502のみを投与した日には、ビヒクルマウスには50μLのPBS腫瘍内注射のみを受け、ICTのみを投与した日には、200μLのPBS腹腔内注射のみを受けた。

腫瘍体積は、各腫瘍の長さ (l、最長測定値) と幅 (w) をノギスで少なくとも週に 1 回測定し、標準的な三角柱の体積公式: V = (l × w2)/2 を使用して決定しました。

4T1 FUGW-FL 蛍光および生物発光デュアルレポーター細胞を 100 mm 組織培養プレート (BD) にプレーティングし (プレートあたり 750,000 細胞)、10% 熱不活化 FBS を添加した RPMI とともに 37 °C で一晩インキュベートしました。 2日目に、細胞培地を吸引し、10%熱不活化FBSを含まないRPMIと交換した。 3日目に、培養物を1μg/mlのCBLB502またはベクター対照としてのPBSのいずれかで3連で処理した。 4日目に、培地を15 mlチューブに収集し、2000 rpm、4℃で10分間遠心分離しました。上清をマウスサイトカイン抗体アレイCシリーズ1000(RayBiotech)を用いてアッセイした。

実験 6、7、および 8 (補足表 2) のマウスからの血清は、顎下サンプリングによって取得されました。サンプルを室温で 1 時間凝固させ、室温で 2000 × g で 10 分間遠心分離し、血清 (上相) をエッペンドルフチューブに収集しました。実験 9 (補足表 2) のマウスからの血清は、伏在サンプリングによって取得されました。サンプルを血清分離チューブ (Thermo-Fisher) に集め、2000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、血清 (上相) をエッペンドルフチューブに集めました。すべての血清サンプルは -80 °C で保存されました。血液サンプルは総循環血液量の 10% を超えませんでした107。

血清サンプルは、テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学の抗体ベースのプロテオミクスコアで分析されました。コアには、以下のサイトカインを含む Milliplex Mouse 32-Plex サイトカインパネル (Millipore) を使用しました: G-CSF、GM-CSF、CCL11、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3 、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12 (p40)、IL-12 (p70)、IL-13、IL-15、IL-17 、CXCL10、CXCL1様、LIF、CXCL5、CCL2、M-CSF、CXCL9、CCL3、CCL4、CXCL2、CCL5、TNF-α、VEGF、および適切なコントロールおよびキャリブレーション標準。範囲を超える値を持つサイトカインについては、対応するサイトカインの観察された最高値を報告しましたが、範囲を下回る値については、標準曲線を半分で割った最低値を報告しました108,109。

腫瘍および脾臓をハサミまたは鉗子で摘出し、重量を量った。腫瘍を細かく切り刻み、コラゲナーゼ（０．２ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ培地（５％ＦＢＳ＋１０ｍＭＨＥＰＥＳ）に移し、脾臓をＰＢＳに懸濁した。組織を破壊する前に、腫瘍を 37 °C で 30 分間穏やかに振盪しました。脾臓および腫瘍組織は、セルストレーナー (70 μm ナイロン) (Corning) を使用し、シリンジプランジを使用して破壊されました。ナイロンメッシュをメディアで数回洗浄しました。サンプルをスピンし（１５００ｒｐｍで５分間）、１ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に５分間再懸濁し、フロー緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で２回洗浄した。細胞を計数し（Nexelom Cellometer）、その後Zombie UV（Biolegend）で生死染色し、室温で15分間インキュベートし、PBSで2回洗浄した。続いて、Fc ブロック (CD16/CD32、BD Biosciences)、抗体染色、単色補正コントロール (Ultra Comp eBeads 補正ビーズ、Thermo Fisher) の調製を行いました。サンプルをホイルで覆い、4 °C で一晩保存しました。細胞内染色は、Foxp3/転写因子染色バッファーセット (eBioscience) と組み合わせた透過処理バッファー (eBioscience) を使用して実行されました。 FoxP3、Ly6G、および Ly6C について陽性染色された細胞と陰性染色された細胞を区別するために示されている場合、蛍光マイナス 1 (FMO) コントロールを使用しました。

CD45 ブリリアントバイオレット 650 (30-F11、バイオレジェンド)、CD11b Pe-Cy7 (M1/70、バイオレジェンド)、CD11c ブリリアントバイオレット 711 (N418、バイオレジェンド)、F4/80 PE-ダズル 594 (BM8、バイオレジェンド)、Ly-6G APC-Fire 750 (1A8、Biolegend)、Ly-6C Brilliant Violet 510 (HK1.4、Biolegend)、CD80 Brilliant Violet 650 (16-10A1、Biolegend)、CD163 PerCP-eFluor 710 (TNKUPL、Biolegend)、および CD285 PE (TLR-5) (ACT5、BD Biosciences) (補足表 10)。

CD45 Alexa Fluor 700 (30-F11、Biolegend)、CD19 PerCP/Cy5 (6D5、Biolegend)、CD3ε Brilliant Violet 650 (17A2、Biolegend)、CD4 PerCP-Cy5.5 (GK1.5、Biolegend)、CD49b PE-dazzle 594 (DX5、Biolegend)、CD8a Brilliant Brilliant Violet 510 (53–6.7、Biolegend)、FoxP3 Alexa 647 (3G3、Thermo-Fisher)、および CD285 PE (TLR-5) (ACT5、BD Biosciences) (補足表 10) 。

CD45 Alexa 700 (30-F11、バイオレジェンド)、CD11b PerCP/Cyanine5.5 (M1/70、バイオレジェンド)、CD11c ブリリアントバイオレット 510 (N418、バイオレジェンド)、F4/80 ブリリアントバイオレット 785 (BM8、バイオレジェンド)、Ly-6G PE/Cy7 (1A8、Biolegend)、Ly-6C Brilliant Violet 605 (HK1.4、Biolegend)、CD80 Brilliant Violet 421 (16-10A1、Biolegend)、CD163 APC (S15049I、Biolegend)、および CD285 PE (TLR-5) ) (ACT5、BD Biosciences) (補足表 11)。

CD45 Alexa 700 (30-F11、Biolegend)、CD19 PerCP/Cy5.5 (1D3/CD19、Biolegend)、CD3ε Brilliant Violet 510 (17A2、Biolegend)、CD4 PE/Cy7 (GK1.5、Biolegend)、CD49b BV421 ( DX5、Biolegend）、CD8a Brilliant Brilliant Violet 711（53–6.7、Biolegend）、FoxP3 Alexa 647（MF-14、Biolegend）、および CD285 PE（TLR-5）（ACT5、BD Biosciences）（補足表 11）。

フローサイトメトリーは、LSRIIサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して実施した。その後の分析は、FlowJo 10.7.1 (FlowJo、Becton Dickinson) を利用して実行されました。

統計分析は、カリフォルニア州サンディエゴのGraphPad SoftwareのWindows用GraphPad Prismバージョン8.0.0を使用して実行されました。全生存期間は、カプラン・マイヤー曲線を使用して評価されました110。ログランク (マンテル-コックス) 検定とゲーハン-ブレスロー-ウィルコクソン検定を使用して、治療間の生存率を比較しました。 ROC 曲線は予測分析のために計算されました。 Holm-Sidak 法を使用した二元配置分散分析とマルチ t 検定の比較 (α = 0.05) を使用して、in vitro および in vivo サイトカイン研究における検出可能な統計的差異を決定しました。ピアソン相関係数 (r) を計算して、生存の可能性と腫瘍免疫浸潤の割合の間の相関関係を評価しました。両側 p 値 ≤ 0.05 を使用して、検出可能な統計的有意性を決定しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文および補足データ 1 を含む補足情報ファイルに含まれています。

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私たちは、テキサス大学 MD アンダーソンがんセンターのジェラルド・デューイ・ドッド・ジュニア寄付特別委員長からの支援に感謝します。 MD アンダーソン南キャンパスのフローサイトメトリーおよび細胞選別コアは、NCI がんセンター支援助成金 (P30 CA016672) によって支援されています。

テキサス大学 MD アンダーソンがんセンター、がんシステムイメージング学部、ヒューストン、テキサス州、77030、米国

ケイレブ・ゴンザレス、サラ・ウィリアムソン、セス・T・ギャモン、サラ・グレイザー、デヴィッド・ピウニカ＝ワームズ

全南大学校医学部、光州、韓国

ジュン・ヘン・イ

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CG、STG、DPW は実験を設計しました。 CGとSWが実験を行いました。 CG、SW、STG、SG、DPWの解析データ。 JHRより試薬を贈呈しました。 CG、STG、DPWが原稿を書きました。著者全員が原稿を編集しました。

David Piwnica-Worms への通信。

テキサス大学 MD アンダーソンがんセンターは、このレポートに記載されている化合物および方法に関する特許出願を行っています (CG、STG、および DPW、発明者)。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Shitao Li および Zhijuan Qiu。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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ゴンザレス、C.、ウィリアムソン、S.、ギャモン、ST 他。 TLR5 アゴニストは、抗腫瘍免疫を強化し、免疫チェックポイント療法に対する耐性を克服します。 Commun Biol 6、31 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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受信日: 2022 年 6 月 20 日

受理日: 2022 年 12 月 23 日

公開日: 2023 年 1 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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TLR5アゴニストは抗炎症作用を増強します