Osx+ の Klotho

Signal Transduction and Targeted Therapy volume 7、記事番号: 155 (2022) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

顎顔面骨欠損は臨床現場でよく見られます。 顎顔面の骨形成を制御する制御ネットワークをより明確に理解することで、骨再生のための新しい治療アプローチの開発が促進されるでしょう。 線維芽細胞成長因子 (FGF) シグナル伝達経路は、顎顔面骨の発達にとって重要です。 I 型膜貫通タンパク質である Klotho は、FGF 受容体複合体の重要な構成要素です。 最近の研究では、骨における Klotho 発現の存在が報告されています。 しかし、頭蓋骨格の発達と修復におけるクロトーの役割は依然として不明です。 今回我々は、遺伝的戦略を用いて、Osx陽性間葉系前駆細胞におけるKlothoの欠失が、生理学的および病理学的条件下で骨形成の大幅な減少につながることを報告する。 Klotho欠損型月葉前駆細胞は、インビトロおよびインビボでも破骨細胞形成を抑制します。 炎症および外傷誘発性の骨量減少の条件下では、KlothoがRank1発現を減弱させることにより、炎症誘発性のTNFRシグナル伝達に対して阻害機能を発揮することが判明した。 さらに重要なことに、我々は、Klothoが正常な状態と病的な状態の両方で明確な発現パターンでヒトの歯槽骨に存在することを初めて示した。 要約すると、我々の結果は、Osx+-間葉系前駆細胞で発現されたKlothoが、下顎歯槽骨の形成と修復中に骨芽細胞の分化と破骨細胞形成を制御する機構を特定した。 Klotho を介したシグナル伝達は、歯槽骨のリモデリングと再生の重要な要素です。 将来の治療法の標的になる可能性もあります。

顎顔面骨には、顔面骨格の形成、消化器系や呼吸器系の保護、隣接する軟組織や歯の構造のサポートなど、重要な生理学的機能があります。1 顎顔面領域の骨欠損は臨床現場でよく見られます。 最も一般的な原因には、炎症、外傷、口腔がん、先天性先天異常などが含まれます2。骨の異常の治療と骨の再生は、その独特の特徴、顔の骨格の美的要件、および重大な身体的変化を引き起こす可能性があるため、常に困難でした。 3 顎顔面骨と他のほとんどの骨の間には、特有の胚起源、骨形成、構造により明らかな違いがあります。4 したがって、顎顔面骨の骨格の発達と修復のメカニズムを解明することは、治療戦略の革新を可能にするために不可欠です。顎顔面骨欠損のこと。

線維芽細胞成長因子 (FGF) シグナル伝達経路は、顎顔面の骨の発達に不可欠です。 FGF 受容体におけるヒトの遺伝子変異は、頭蓋顔面骨格の成長と発達における複数の異常の原因として特定されています。5 Klotho (KL) は、FGF 受容体 1 (FGFR1) 複合体の必須成分である I 型膜貫通タンパク質です。6膜に固定された Klotho の主な役割は、FGFR1 の FGF23 への結合能力を増加させるため、線維芽細胞成長因子 23 (FGF23) の共受容体として作用することです。 FGF23 は主に骨細胞と骨芽細胞から分泌され、ミネラルイオンの恒常性を維持する働きをするホルモンです。7 Klotho は主に腎臓、副甲状腺、および脈絡叢で発現しています。8 最近の研究では骨内の Klotho 転写物が特定されており、重要な局所的影響が示唆されています。骨代謝における Klotho の調節機能。9 Klotho 低形質マウスは骨量が低く、骨代謝回転が低下しています。6 しかし、この表現型が骨における Klotho の細胞自律的機能欠陥によるものなのか、全身の変化によるものなのかを区別することは困難でした。別の研究では、Prx1Creを使用して、間葉系幹細胞のKlothoを条件付きで切除しました。 Prx1Cre;KLfl/fl マウスは、コントロールと同等の骨格表現型を明らかにしました。 しかし、これらのマウスは、尿毒症条件下で骨格内の FGF23 発現を増加させることができませんでした。10 骨細胞における Klotho の発見以来、9 Kokuba et al. Klotho らは、骨細胞特異的な Klotho アブレーションにより、骨芽細胞の活性の亢進と相まって、骨形成が顕著に増加することを実証しました。 11 これらのマウス モデルの骨格表現型の不一致は、おそらく骨細胞の異なる集団における Klotho の役割が異なるためであると考えられます。

特定の胚系統と発生パターンにより、頭蓋顔面骨格の大部分は神経堤細胞に由来し、膜内骨化および軟骨内骨化によって形成されますが、四肢骨格は側板中胚葉細胞の産物であり、軟骨内骨形成を受けます12。 Klotho の機能は骨格の領域によって異なる場合があります。 Klothoのミスセンス変異に関連する腫瘍性石灰沈着症などの遺伝病の患者が重度の頭蓋顔面異常を患っていることは注目に値し、13、頭蓋顔面骨の発達におけるKlothoの重要な役割を強調している。 しかし、顎顔面骨の骨化、ならびに顎顔面骨の損失および修復の病因における Klotho の調節機能は不明のままです。

この研究では、これらの疑問を研究するために、Osterix+ (Osx+) 間葉前駆細胞の Klotho を標的として除去した新しいマウス モデルを作成しました。 Osx+前駆細胞におけるKlothoの不活化は、下顎歯槽骨形成の減少や骨吸収の減少などの骨格変形を引き起こしました。 これにより、発生中に歯槽骨の体積が異常に増加しました。 さらに、間葉系前駆細胞によって発現される Klotho が破骨細胞形成に影響を与える制御機構を発見しました。 われわれは、歯槽骨喪失と外傷に応答して、Klothoが腫瘍壊死因子シグナル伝達とRankl発現を標的とすることで炎症誘発性の骨吸収を阻害しながら、骨修復中の骨形成を促進するという重要な役割を担っていることを発見した。 さらに、我々はヒト歯槽骨におけるKlothoの存在と、健康な状態と病的な状態の両方におけるその独特の発現パターンを初めて報告した。

われわれは、Osxを発現する間葉前駆細胞におけるKlotho発現を条件付きで除去することにより、顎顔面骨の発生におけるKlothoの役割の可能性を調査した。 これは、KLfl/flマウスとOsxCreマウスを交配することによって達成されました（補足図1a、b）。 OsxCre;KLfl/fl マウスは、予想されるメンデル遺伝率で生まれ、対照同腹子と比較して体重は同様でした（補足図1c）。 血清Ca2+、Pi、およびインタクトFGF23レベルはOsxCre;KLfl/flマウスでは変化せず、Klothoの組織特異的機能を単離することができました（補足図1e）。 アリザリンレッド/アルシアンブルー染色では、新生仔OsxCre;KLfl/flマウスの頭蓋顔面骨における骨格石灰化の有意な変化は検出されませんでした（補足図1f）。 生後3週間のμCT分析により、OsxCre;KLfl/flマウスとコントロールの下顎第一大臼歯分岐部領域の歯槽骨体積が同等であることが明らかになりました（図1a）。 変異体では、骨体積/組織体積（BV/TV、%、p = 0.180）がわずかに増加しましたが、有意ではありませんでしたが、小柱の間隔は減少しました（Tb.Sp、μm、p = 0.051）（図1b）。 これらのコンディショナルノックアウトマウスでは、同腹子コントロールと比較して、後期段階で有意に高い歯槽骨体積が観察されました（図1c）。 μCT定量分析により、対照同腹子と比較した場合、変異体のBV/TV（p = 0.012）および小柱の厚さ（Tb.Th、mm、p = 0.020）が有意に高いことが明らかになりました。 Tb.Spでは差は観察されませんでした（p = 0.170）（図1d）。 また、生後 3 週目および 11 週目のマウスの下顎骨の H&E 染色も行いました。 驚くことではないが、根分岐部領域の小柱骨量は、OsxCre;KLfl/fl マウスの方が高かった。 下顎臼歯の組織学には変化は観察されませんでした（図1e、f）。

Osx+細胞のKlotho欠損は、骨のリモデリング障害を引き起こします。 a、c 生後3週目（a）および11週目（c）のOsxCre;KLfl/flマウスおよびその対照同腹子の歯槽骨のマイクロコンピュータ断層撮影スキャンからの三次元再構成。 b、d 3-（b、n = 5、OsxCre）における骨量/組織量（BV / TV、％）、小柱の厚さ（Tb.Th、μm）、および小柱間隔（Tb.Sp、μm）の定量分析群およびOsxCre;KLfl/fl群ではn = 8）および11週齢のマウス（d、n = 3）。 e、f 3週齢マウス（e）および11週齢マウス（f）の下顎第1大臼歯の根分岐部における歯槽骨のヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）染色。 四角で囲まれた領域の高倍率は、OsxCre;KLfl/fl マウスの歯槽骨量の増加を示しています。 n = 5. g、h コントロールおよび OsxCre;KLfl/fl マウスからの歯槽骨のカルセイン二重標識。 代表的な画像 (g) および骨形成速度/骨表面 (BFR/BS、μm3/μm2/日)、ミネラル付着速度 (MAR、μm/日)、および石灰化表面/骨表面 (MS/BS、%) の定量分析(h)。 n = 8。i RUNX2 と OSX:GFP の二重蛍光染色。 四角で囲った領域の高倍率では、第 1 大臼歯根分岐部での RUNX2 および OSX:GFP 陽性細胞の分布が示されています。 j、k 3週齢マウス（j）および11週齢マウス（k）におけるRUNX2またはOSX:GFP陽性細胞/総骨芽細胞の定量。 OsxCre グループでは n = 6、OsxCre;KLfl/fl グループでは n = 4。 l TRAP染色。 四角で囲まれた領域の高倍率は、OsxCre;KLfl/fl マウスにおける TRAP 陽性細胞の数が減少していることを示しています。 m 3週齢マウス（左）および11週齢マウス（右）におけるTRAP陽性細胞/骨表面の定量。 OsxCre グループでは n = 4、OsxCre;KLfl/fl グループでは n = 5。 生後11週目のマウスにおけるAcp5、Mmp9、Rank1、Opg、およびRank1/Opg転写のqRT-PCR分析。 OsxCre グループでは n = 4、OsxCre;KLfl/fl グループでは n = 6。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。 すべてのデータは平均値±SEMとして示されています。 スケールバー、1 mm (a、c)、200 μm (e)、50 μm (g、i)、および 100 μm (l)

クロトー切除マウスにおける歯槽骨の体積の増加は、骨の形成と吸収の不均衡に起因する可能性があります。 そこで、歯槽骨の動的組織形態計測を実施しました。 その結果、OsxCre;KLfl/fl マウスでは、対照と比較して、ミネラル表面/骨表面 (MS/BS)、ミネラル付着速度 (MAR)、および骨形成速度/骨表面 (BFR/BS) が顕著に下方制御されていることが示されました (図 1)。 1g、h）。 次に、免疫蛍光染色により骨芽細胞系譜細胞の活性を測定しました。 Runt関連転写因子2（Runx2）陽性細胞の数は変異マウスでは変化しなかったが、Klotho欠失によりOsx免疫反応性が有意に減少した（図1i〜k）。 一般に、Runx2 は前骨芽細胞に分化した前駆細胞を定義しますが、Osx の発現は骨芽細胞への分化を意味します 14。 これらの結果は、Klotho アブレーションが主に骨芽細胞の活性と成熟に影響を与えたことを示唆しています。

酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色により、年齢が一致した対照と比較して、OsxCre;KLfl/flマウスの歯槽骨におけるTRAP陽性破骨細胞/骨表面の有意な減少が明らかになった（図1l、m）。 さらに、Acp5 (Trap) やマトリックスメタロプロテイナーゼ 9 (Mmp9) などの破骨細胞の分化と活性化に関連する遺伝子は、変異体では顕著に抑制されていました。 次に、骨吸収を媒介するために骨芽細胞によって分泌される重要な因子を評価し、歯槽骨における核因子κBリガンド受容体活性化因子（Rankl）の減少、オステオプロテゲリン（Opg）発現の増加、およびRankl/Opg比の低下を発見し、これはクロトー間葉系の影響を示唆しています。破骨細胞形成に対する前駆細胞依存的な効果（図1n）。

私たちは、in vivo での歯槽骨発達における Klotho の極めて重要な機能を確立したため、次に Klotho の喪失が骨化をどのように阻害するかを調査しました。 OsxCre;KLfl/fl および OsxCre マウスの下顎骨から全 RNA を単離し、RNA シーケンス (RNA-seq) を行いました。 全体的なトランスクリプトームは、対照マウスとクロトー切除マウスとの間で著しく変化した。 クロトー枯渇下顎骨では、発現した合計26,758個の遺伝子のうち、510個の遺伝子が上方制御され、432個の遺伝子が下方制御されました（図2a）。 象牙質マトリックス酸性リンタンパク質 1 (Dmp1)、分泌リンタンパク質 1 (Spp1)、コラーゲン I 型アルファ 2 (Col1α2)、およびオステモジュリン (Omd) などの骨形成に関連する重要な調節因子が、変異体では大幅に抑制されていることが判明しました。図2b)。 同様に、遺伝子オントロジー（GO）分析は、Klotho欠損によって下方制御された遺伝子が、骨格系の発達、骨化、生体ミネラル組織の発達などの間に高度に発現されることを示しました（図2c）。

Klotho は、骨形成分化を促進することで骨格系の発達を促進します。 クロトー切除下顎骨において、510 個の遺伝子が独自に上方制御され、432 個の遺伝子が下方制御されていることを示すベン図 (p 値 < 0.05)。 n = 3。 b 骨形成に関連する代表的な遺伝子のヒートマップ。 赤は発現が上方制御されていることを示します。 青色は発現が下方制御されていることを示します。 c 差次的に発現された遺伝子（DEG）全体における下方制御された遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）濃縮分析。 d OsxCreおよびOsxCre;KLfl/flマウスからの頭蓋冠初代骨芽細胞における骨形成誘導のそれぞれ7日目（7d）および14日目のアルカリホスファターゼ（ALP）染色およびアリザリンレッド染色（ARS）。 n = 3。e 14日間の誘導後のOsx、Runx2、Alp、Dmp1、Col1α1、およびRank1の転写。 n = 3。 f Klotho (OE) または空のロード (NC) を過剰発現するレンチウイルス粒子をトランスフェクトした後の ALP 染色および ARS。 n = 3.g 誘導の 14 日後の遺伝子の転写。 n = 3。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 すべてのデータは平均値±SEMとして表示されます。

我々は、in vitro での骨形成の媒介における Osx+ 前駆体からの Klotho の役割についての研究を続けました。 OsxCre および OsxCre;KLfl/fl マウスからの骨芽細胞を培養しました。 骨形成条件下で7日および14日間培養した後、Klotho欠失骨芽細胞ではアルカリホスファターゼ（ALP）およびアリザリンレッド染色（ARS）の強度が大幅に減少し、同時にOsx、Runx2、アルカリホスファターゼ（Alp）などの骨形成関連マーカーも下方制御されていました。 、Dmp1、およびコラーゲンI型アルファ1（Col1α1）は、骨形成分化の減少を示しています（図2d、e）。 対照的に、KLfl/fl からの骨芽細胞は、Klotho を過剰発現するためにレンチウイルスによってトランスフェクトされ、骨形成培地下で培養されました。 Klothoの過剰発現は、骨形成関連マーカーのより高い発現レベルを伴い、ALPおよびARS強度の顕著な増加をもたらします（図2f、g）。 これらのデータは、KlothoがOsx+細胞の骨形成分化を促進することによって頭蓋顔面骨格の発達を促進することを示唆しています。

上記のデータは、骨芽細胞の Klotho が下顎歯槽骨の形成に重要であることを示しています。 したがって、我々は、Klotho欠失がin vivoでの病的骨損失に影響を与えるかどうかを決定した。 まず、標準的な根尖性歯周炎 (AP) モデルを確立しました。 この目的を達成するために、OsxCre;KLfl/fl マウスおよび対照マウスの下顎第一大臼歯の歯髄を口腔微小環境に曝露した。 μCTにより、モデル誘導の3週間後、OsxCre;KLfl/flマウスと対照マウスの両方の下顎第一大臼歯で顕著な歯槽骨損失が見られることが明らかになった。 驚くべきことに、OsxCre;KLfl/fl AP マウスは、対照 AP グループと比較して、根尖病変領域と小柱パターン因子 (Tb.Pf、1/μm) の有意な増加、および歯根の短縮を特徴とする、より深い X 線透過領域を示しました (図.3a、b、補足図2a、b)。 組織学的検査により、OsxCre;KLfl/fl マウスと対照マウスの両方が正常な条件下で根尖周囲構造を保存していることが示されました。 AP は、歯槽骨吸収の増加を伴い、影響を受けた歯の根尖周囲の炎症細胞による浸潤を引き起こしました（図 3c）。 遺伝子発現分析により、APが対照と比較して腫瘍壊死因子-α（Tnf-α）およびインターロイキン-6（Il-6）の発現レベルの増加を引き起こすことが実証されました（図3d）。

Klotho 欠失は歯槽骨の根尖病変を促進します。 根尖性歯周炎および偽グループにおけるOsxCre;KLfl/flマウスおよび対照マウスの下顎第一大臼歯のμCT画像。 赤い矢印は根尖周囲病変を示しています。 b 根尖周囲面積（mm3）および根尖周囲径（μm）を含む根尖周囲病変面積の定量分析、n = 5。 BV/TV (%)、Tb.Th (μm)、小柱パターン因子 (Tb.Pf、1/μm)、および Tb.Sp (μm) を含む海綿骨パラメータ、OsxCre Sham および AP グループの n = 6、 OsxCre;KLfl/fl Sham グループでは n = 7、OsxCre;KLfl/fl AP グループでは n = 8。 c 下顎骨の H&E 染色は、根尖性歯周炎によって誘発された根尖周囲病変を示しています。 破線は根尖病変の範囲を示します。 n = 5。 d 根尖骨周囲の Tnf-α および Il-6 の転写発現。 n = 5。e、f TRAP 染色および TRAP 陽性細胞/骨表面の定量。 四角で囲まれた領域の倍率が高いほど、OsxCre;KLfl/fl マウスの病変領域でより多くの TRAP 陽性細胞が示されます。 n = 3.g 根尖周囲領域における RANKL の免疫蛍光染色。 四角で囲った領域は、OsxCre;KLfl/fl AP グループにおける RANKL の発現が高いことを示しています。 黄色の破線は、第 1 大臼歯の遠位歯根の境界面を示しています。 h 下顎第一大臼歯の根尖骨における Rankl、Opg、および Rankl/Opg 比の遺伝子発現。 OsxCre Sham および OsxCre;KLfl/fl AP グループでは n = 4、OsxCre-AP グループでは n = 5、OsxCre;KLfl/fl Sham グループでは n = 3。 i 下顎の第 1 大臼歯の遠位根を取り囲む根尖骨における OSX:GFP と tdTomato の免疫蛍光二重染色。 四角で囲った領域は、根尖骨周囲の OSX:GFP および tdTomato 二重陽性細胞の高倍率を示しています。 白い矢印は二重陽性細胞を示します。 j OSX:GFP および tdTomato 二重陽性細胞の定量化。 OsxCre-sham グループでは n = 4、OsxCre-AP グループでは n = 13、OsxCre;KLfl/fl-sham グループでは n = 8、OsxCre;KLfl/fl-AP グループでは n = 12。 *、$、#p < 0.05、**、##p < 0.01、***、###p < 0.001、****、####p < 0.0001、* は AP と偽を示し、$ は AP と偽を示しますOsxCre シャムと OsxCre;KLfl/fl シャム、# は OsxCre AP と OsxCre;KLfl/fl AP を示します。 すべてのデータは平均値±SEMとして示されています。 スケールバー、200 μm (a、c)、100 μm (e)、および 50 μm (g、i)

Klothoアブレーションを受けたマウスは、対照マウスよりも破骨細胞数の顕著な増加と歯根のより深刻な破壊を示し、Klothoの非存在下では炎症性骨損失において骨吸収が上昇していることを示唆していることは注目に値します（図3e、f）。 また、AP 病変が破骨細胞分化のために Rank1 発現の上昇を示すことも注目に値します。15 実際、AP 病変部位では、OsxCre;KLfl/fl マウスは対照マウスと比較して Rank1 発現が増加しており、これは転写レベルで一貫していました (図 1)。 3g、h）。 一方、Opg発現は炎症により減少し、APを有するKlotho切除マウスにおいて最高のRank1/Opg比をもたらした(図3h)。 AP のほとんどの症例では、骨吸収と骨形成の間に新たに確立された平衡により、骨量減少は自然に制限されます 16。 したがって、我々は次に、Klotho の欠乏が AP 中のこの保護制御プロセスに影響を与えるかどうかを調べました。 我々は、感染による根尖周囲骨量減少の進行中のOsx+系統細胞を視覚化するために、tdTomato遺伝子を発現する対照マウスと変異マウスを作製した。 OsxCre誘導tdTomato発現によって評価されたOsx発現細胞とその子孫は、歯髄、歯根膜、ならびに歯槽骨の骨芽細胞および骨細胞で豊富に検出されました（図3i）。 tdTomato と GFP の免疫蛍光二重標識は、AP が Osx:GFP+ 細胞の生成を有意に誘導し、これも tdTomato+ であることを示しました（図 3j）。 これは、病理学的な頂端微小環境が、骨形成分化を促進することによって硬組織形成能力をある程度維持していることを示唆している。 さらに重要なことに、Osx:GFP/tdTomato二重陽性細胞の有意な減少が変異体で検出され、Klothoを欠く細胞の骨形成能が損なわれていることを示唆しています。

さらに、歯槽窩治癒モデルを作成することにより、歯槽骨修復における Klotho の機能を評価しました。 3DボリュームμCT再構成により、コントロールマウスでは抜歯後21日で抜歯部位の骨治癒が完了していることが明らかになった。 しかし、変異体は骨表面があまり組織化されておらず、歯槽窩の治癒が遅れていました（図4a）。 次いで、治癒部位を占める再生骨を評価した。 OsxCre;KLfl/fl マウスの新しく形成された骨では、BV/TV および骨塩密度 (BMD) が大幅に減少しました。 骨表面/骨体積 (BS/BV)、骨梁数 (Tb.N)、および Tb.N には差異は観察されませんでした。 変異体のSp (図4b)。 OsxCre;KLfl/fl マウスでは、抜歯窩内の相互接続された歯槽骨が少なく、骨髄面積の増加を伴いました（図 4c）。 抜歯後の骨の再構築は、骨芽細胞と破骨細胞の協調によって行われるため 17、次に骨表面の破骨細胞を列挙しました。 両方のグループの治癒窩の骨表面には十分な破骨細胞が付着していました。 ただし、骨周囲あたりの破骨細胞の数は、OsxCre;KLfl/fl マウスで大幅に増加しました（図 4d、e）。 免疫蛍光二重標識により、窩内の海綿骨周囲の Klotho 欠損細胞における Runx2 陽性骨芽細胞が統計的に減少していることが示されました。 同様に、対照と比較してKlotho欠損マウスではより少ないGFP + / tdTomato +骨芽細胞が検出され（図4f、g）、Klotho欠失が外傷時の骨芽細胞分化の抑制につながったことを示唆しています。 総合すると、これらの結果は、OsxCre;KLfl/fl マウスの抜歯窩の治癒が遅いのは、骨吸収の促進を伴う骨形成の減少による可能性があることを示しています。

OsxCre;KLfl/fl マウスでは歯槽骨修復が減弱しています。 a、b 抜歯窩における骨治癒のμCT画像と定量的分析。 白い楕円は上顎の抜歯窩を示します。 青い矢印は歯窩の治癒が遅れていることを示します。 OsxCre グループでは n = 3、OsxCre;KLfl/fl グループでは n = 5。 c – e コントロールマウスおよびOsxCre;KLfl / flマウスの抜歯窩のH＆EおよびTRAP染色。 四角で囲った領域の倍率を高くすると、OsxCre;KLfl/fl マウスの眼窩内の骨修復が少なく、TRAP 陽性細胞が増えていることがわかります。 OsxCre グループでは n = 3、OsxCre;KLfl/fl グループでは n = 6。 f RUNX2 免疫蛍光染色と OSX:GFP および tdTomato の二重蛍光標識は、Klotho 欠失マウスにおける Runx2 または OSX:GFP および tdTomato 陽性骨芽細胞の減少を示します。 g ソケット内の RUNX2 陽性細胞または OSX:GFP および tdTomato 二重陽性細胞の定量化。 OsxCre グループでは n = 4、OsxCre;KLfl/fl グループでは n = 7。 *p < 0.05、**p < 0.01。 すべてのデータは平均値±SEMとして示されています。 スケールバー、500 μm (a)、200 μm (c)、100 μm (d)、または 50 μm (f)

この研究のために作成された根尖性歯周炎および抜歯モデルでは、骨芽細胞と破骨細胞の両方の活性を媒介することにより組織修復に対するクロトー欠失の悪影響が確認されました。 骨芽細胞系譜細胞におけるクロトー欠損が骨吸収を媒介する機構を、骨髄由来の破骨細胞と共培養した頭蓋冠由来の骨芽細胞を用いて研究した。 Klothoは、KLfl/flマウスから得た骨芽細胞にアデノウイルス媒介Cre（Ad-CRE）を投与することによって除去されました（図5e）。 TRAP+多核細胞の数の減少によって示されるように、Klotho欠損骨芽細胞は破骨細胞形成をサポートする能力の低下を示しました（図5a、b）。 破骨細胞の活性を測定するために、骨芽細胞と破骨細胞の共培養システムでピット吸収アッセイを実行しました。 TRAP染色結果と一致して、Klotho欠損骨芽細胞との共培養における破骨細胞は、対照骨芽細胞と比較して吸収活性が低下した（図5c、d）。 我々は、破骨細胞の活性を調整するために骨芽細胞によって分泌される重要な因子をスクリーニングし、Rank1発現がKlotho除去骨芽細胞では下方制御される一方、Klotho過剰発現のある細胞では上方制御されることを発見した（図2e、g）。 さらに、Rank1は、KLfl/flマウスの骨芽細胞にAd-CREによってトランスフェクトされた後に下方制御された（図5f）。 これらのデータは、骨芽細胞の Klotho が細胞非自律的に作用して破骨細胞の分化と活性を媒介することを実証しました。

骨芽細胞-Klotho は破骨細胞の形成を媒介し、TNF-α 誘導性の TNF 受容体 I 活性化を抑制します。 a〜d KLfl / flマウスの初代骨芽細胞にアデノウイルス媒介Cre（Ad-CRE）をトランスフェクトし、Ad-GFPを対照として使用しました。 トランスフェクトされた骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ (BMM) を TNF-α またはビヒクル処理下で共培養しました。 a、b 9 日間の誘導後の TRAP 染色と定量分析。 n = 3。c、d 13 日間の誘導後のピット吸収アッセイ。 n = 4。 e アデノウイルストランスフェクション後の KLfl/fl マウスの骨芽細胞における Klotho の遺伝子発現。 n = 6。 f 破骨細胞形成関連遺伝子 Rank1 の転写。 n = 3.g Klotho 過剰発現 MC3T3 細胞を TNF-α (10 ng/mL、60 分) またはビヒクルで処理し、その後 Klotho 用の ChIP で処理しました。 DNA は qPCR によって定量され、結果はコントロール IgG に対する濃縮倍率として示されました。 n = 3。h DEG で上方制御された遺伝子の GO 濃縮分析。 n = 3。i OsxCre;KLfl/fl マウスおよびコントロール マウスの AP モデルにおける Tnfr1 の遺伝子発現。 OsxCre-sham および OsxCre-AP グループでは n = 6、OsxCre;KLfl/fl-sham および OsxCre;KLfl/fl AP グループでは n = 3。 j Klotho過剰発現前駆細胞におけるKlothoおよびTNFR Iの免疫細胞化学。 k 免疫細胞化学は、細胞質および核における NF-κB p65 の分布を示します。 l TNF-α刺激中のTNFR I発現の定量化。 NC-CTRL および OE (Klotho Overexpression)-TNF-α グループでは n = 4。 NC-TNF-α および OE-CTRL グループでは n = 6。 m NF-κB p65 の核内局在化の定量化。 NC-Vehicel および NC-TNF-α グループでは n = 3。 OE-Vehicle および OE-TNF-α グループでは n = 4。 n R-7050（TNFR I阻害剤）と組み合わせたTNF-αで処理した場合の、初代骨芽細胞およびKlotho欠失骨芽細胞におけるRank1の遺伝子発現。 n = 3. o Klotho 過剰発現 MC3T3 細胞に対して共免疫沈降アッセイを実施しました。 タンパク質を収集し、Klotho または TNFR I 抗体で免疫沈降しました。 Klotho または TNFR I 抗体を使用してウェスタンブロットを実行し、Klotho と TNFR I の間の相互作用を決定しました。IP 免疫沈降。 *、$、†p < 0.05、**、##、§§p < 0.01、***、$$$、§§§p < 0.001、****、####p < 0.0001、*は、AP 対偽、またはビヒクル対 TNF-α を示します。 $ は、OsxCre シャムと OsxCre、KLfl/fl シャム、または NC 車両と OE 車両を示します。 ＃は、Ａｄ−ＧＦＰビヒクル対Ａｄ−ＣＲＥビヒクル、ＯｓｘＣｒｅ ＡＰ対ＯｓｘＣｒｅ；ＫＬｆｌ／ｆｌ ＡＰ、またはＮＣ−ＴＮＦ−α対ＯＥ−ＴＮＦ−αを示す。 §は、TNF-α 対 TNF-α + R-7050 を示します。 † は、Ad-GFP TNF-α + R-7050 と Ad-CRE TNF-α + R-7050 を示します。 すべてのデータは平均値±SEMとして示されています。 スケールバー、100 μm (a、c)、および 50 μm (j、k)

顎顔面骨欠損は、炎症や外傷などのいくつかの要因によって引き起こされる可能性があります。2 炎症や外傷による骨損失の共通の特徴の 1 つは、TNF シグナル伝達の活性化です。18 この側面を調査するために、TNF-α が骨芽細胞に導入されました。炎症反応および破骨細胞形成における Klotho 欠損の影響を調べるための破骨細胞共培養システム。 TNF-α は、対照群と変異体群の両方で骨芽細胞誘導性の破骨細胞分化を増幅しました。 通常の条件下では、培養されたKlotho欠損骨芽細胞では破骨細胞形成が減弱されましたが、驚くべきことに、TNF-α投与時のKlotho除去骨芽細胞の共培養では破骨細胞の数と活性がさらに大幅に増加しました（図5a〜d）。 これには、Rank1発現の上昇が伴い、骨芽細胞におけるTNF-αシグナル伝達によって誘導されるRank1と炎症時のその後の破骨細胞形成の抑制においてKlothoが重要な役割を果たしている可能性があることを示しています（図5f）。 さらに、ChIP-qPCR を適用して、Klotho が Rank1 の指定された調節領域に結合できるかどうかを検出しました。 Klothoが過剰発現した骨芽細胞をTNF-αで処理すると、Klothoが-140 kB Rank1遠位調節要素と誘導的に関連していることが明らかになり、Klothoが炎症下でRank1転写を抑制する核機能を示す可能性があることが示されました（図5g）。

Klotho枯渇下顎骨の遺伝子のGO分析により、上方制御された遺伝子は外部刺激に対する応答の制御、炎症反応の制御、および腫瘍壊死因子媒介シグナル伝達経路に関連していることが示されました（図5h）。 実際、TNF-α 主要受容体である TNF 受容体 I (Tnfr1) のより高い発現レベルが OsxCre;KLfl/fl マウスで観察され、AP 下の OsxCre;KLfl/fl マウスで最も高いレベルが検出されました。 これは、Klothoが炎症反応に悪影響を与える可能性があることを示すさらなる兆候です（図5i）。 この仮説を検証するために、我々はまず骨芽細胞でKlothoを過剰発現させ、通常の条件下では細胞膜でのTNFR I発現が有意に抑制されていることを発見しました（図5j）。 TNF-αで処理した対照骨芽細胞の免疫蛍光検査により、ビヒクル処理グループと比較してTNFR I発現が高いことが明らかになった。 しかし、この上方制御は、Klotho過剰発現によって鈍化した(図5l)。 さらに、Klothoの過剰発現は、TNF-α誘導性のNF-κB p65サブユニットの核移行を有意に抑制し、その結果、同様にTNF-αに曝露された対照細胞と比較して、総骨芽細胞数に対する活性化骨芽細胞の減少をもたらした（図5k、m） ）。 R-7050 は、TRADD や RIP などの細胞内アダプター分子と TNFR I の結合をブロックする小分子 TNFR 阻害剤です 19。 注目すべきことに、R-7050 の投与は TNF-α 誘発 Rank1 発現を妨げ、これは Klotho アブレーションの影響なしに起こりました。これは、KlothoがTNF-α刺激下でその下流分子ではなくTNFR I自体に影響を与えることを示しています（図5n）。 Klotho と TNFR I 間の相互作用の可能性をさらに調査するために、免疫共沈降アッセイを実施しました。 結果は、KlothoがTNFR Iに直接結合することができ、それがTNFR Iシグナル伝達経路を妨害する可能性があることを示した(図5o)。

Klotho の発現は、腎臓、胎盤、肺、膵臓、乳房、副甲状腺、心臓、血管系、脳、およびいくつかの内分泌組織など、さまざまなヒト組織で確認されています 20。さらに最近では、Klotho の発現が骨組織でも発見されています。マウスでは Klotho 遺伝子多型が存在し 11、ヒトでは Klotho 遺伝子多型が加齢に伴う骨密度の変化と関連していると考えられています 21。しかし、ヒトの骨におけるその発現の詳細な特徴付けは不足しています。 我々は、正常な個人およびAP患者からサンプルを収集することにより、ヒト歯槽骨組織におけるKlothoの発現を調べた。 免疫染色により、KLOTHOが通常の生理学的条件下で歯槽骨内の骨芽細胞および骨細胞の細胞膜および細胞質で高度に発現されることが実証されました（図6b）。 病理学的状態では、H&E染色により、骨組織は炎症関連細胞に囲まれており、骨組織の周囲にはより多くのTRAP陽性破骨細胞が存在することが示されました（図6a）。 さらに重要なことに、KLOTHO陽性細胞の割合はAPとともに顕著に上昇し、遺伝子発現が増加する傾向がありました（図6b、c）。 Klotho転写の上昇は、APと抜歯を行ったマウスでも観察されました（補足図3）。 興味深いことに、AP患者ではKLOTHOタンパク質の発現が細胞核に局在していることが観察され、炎症条件下でKlothoが核で機能する可能性があることが示唆されました（図6d）。

根尖性歯周炎におけるヒト歯槽骨は、Klotho 発現パターンの変化と関連しています。 a 健常者および AP 患者の H&E および TRAP 染色。 b ヒト歯槽骨における KLOTHO 陽性細胞の免疫蛍光染色と定量。 n = 健康な人では 8、AP 患者では 12。 c 健常者およびAP患者の歯槽骨におけるKLOTHOの遺伝子発現。 健康な人では n = 4、AP 患者では n = 7。 d 共焦点顕微鏡法から得られた 3D 画像は、KLOTHO タンパク質発現パターンを示します。 n = 4。e 概略図は、Osx+-間葉前駆細胞のKlothoが、下顎骨の形成と修復中に骨形成促進効果と抗炎症効果を発揮することを示しました。 すべてのデータは平均値±SEMとして示されています。 スケールバー、100 μm (a)、50 μm (b)、および 10 μm (c)

まとめると、これらの結果は、間葉系前駆細胞の Klotho が、骨形成分化を直接促進し、非細胞自律的に破骨細胞形成を調節することにより、下顎歯槽骨の形成と修復に重要な役割を果たしていることを示しています。 さらに重要なことに、骨芽細胞のKlothoは、炎症によって誘発される骨損失を抑制する中心的な機能を持っています（図6e）。 正常な生理学的および病理学的状態におけるヒト歯槽骨におけるKlothoの独特の発現パターンは、歯槽骨の形成および再生を刺激するために、間葉前駆細胞におけるKlothoの発現を調節する道を開く。

今回我々は、下顎歯槽骨の形成と修復の調節におけるKlothoの極めて重要な機能を実証する、Osx特異的なKlotho欠失の新規マウスモデルを作製した。 OsxCre;KLfl/fl マウスは、発生段階および成体段階で歯槽骨形成の減少を示しました。 さらに、RNA-seq 解析により、変異体下顎骨では骨形成関連遺伝子の発現が大幅に下方制御されていることが明らかになりました。 このことは、Osx発現細胞で発現したKlothoが下顎歯槽骨形成時の骨形成を刺激する機能を持っていることを示唆している。 変異体における骨形成分化の障害は、骨芽細胞数の減少と骨減少症を示す Klotho 低形質マウスで観察されるものと類似しています。22 Hikone et al。 kl/kl マウスで歯根膜と下顎歯槽骨の変化を発見しました。 歯槽骨の異常には、ALP+ 骨芽細胞と TRAP+ 破骨細胞の数が少なく、OsxCre;KLfl/fl マウスで見られるものと同様でした 23。ただし、kl/kl マウスでは、ミネラル代謝が著しく障害されているため、何であるかを解釈することが困難です。骨細胞における Klotho 発現の破壊は、細胞自律的な方法で骨格の表現型をある程度説明します。 実際、kl/kl マウスの歯槽間中隔の異常な歯周組織は、低 Pi 食を投与することで回復する可能性があります 23。 この研究では、OsxCre;KLfl/fl マウスの全身のミネラルイオン恒常性は影響を受けず、これにより詳細な分析が可能になりました。 Klotho の組織固有の役割。 OsxCre;KLfl/flおよびOsxCreマウスの初代骨芽細胞のin vitro培養により、Klothoの喪失が骨形成分化を抑制することがさらに確認され、歯槽骨形成の調節におけるKlothoの細胞自律的役割が示された。 さらに、FGF23 は下顎骨の骨芽細胞、骨細胞、セメント芽細胞、および象牙芽細胞で発現しており、これは骨芽細胞の発達および基質石灰化と高度に相関していました 24。局所的な Klotho/FGF23 シグナル伝達は、歯周組織および歯槽骨の発達を媒介する機能を持っています。23,24研究では、下顎骨におけるFgfr1とEgr1、およびiFGF23の遺伝子発現は、変異体と対照同腹子間で同等であり（補足図1d、e）、KlothoがFGFシグナル伝達に依存しない方法で機能する可能性があることを示唆しています。 さらに、Klotho の除去により、修復応答における Osx+ 間葉前駆細胞の分化が抑制されます。 Klotho欠損間葉系前駆細胞の骨形成分化の低下は、骨芽細胞活性と骨形成速度をアップレギュレートした骨細胞特異的Klotho欠失マウスの表現型と矛盾しているように思われた11。我々は、Klotho欠損マウスで報告されている骨表現型におけるこの違いが原因であると仮説を立てている。これは、特定の細胞型に対する Klotho の欠失の相対的な影響の違い、および軟骨内骨形成と膜内骨形成の明確な特徴に起因すると考えられます。 たとえば、頭蓋顔面骨は移動する頭蓋神経堤細胞から発達し、長骨の形成とは異なります 25。いくつかの成長因子、受容体、およびそれらの下流シグナル伝達経路は、頭蓋顔面骨に対して軸骨格および付属肢骨格において多様な機能を持っています。4 OsxCre;KLfl/fl マウスで観察された表現型は、下顎歯槽骨形成中の Klotho の特定の役割を強調しています。 最も注目すべき臨床例は、びまん性骨減少症や頭蓋冠の斑状硬化症、歯根の短縮などの重度の口腔顔面表現型を伴う、クロトーのホモ接合型ミスセンス変異である腫瘍性石灰沈着症の患者です。 13 後者は、OsxCre;KLfl/でも観察されました。 AP 下の fl マウス。これは、さまざまな骨格コンポーネントにわたる Klotho の独特の調節機構を強調しています。

重要なことに、我々は、Osx+間葉前駆細胞におけるKlotho欠失が破骨細胞形成を有意に抑制することに注目した。 われわれは、OsxCre;KLfl/fl マウスにおいて、破骨細胞関連マーカーの発現の抑制を伴う破骨細胞の有意な減少を観察した。 この表現型は、骨芽細胞と破骨細胞の数が減少し、皮質骨の厚さが減少した Klotho 低形質マウスの表現型に似ています 22,26。さらに、長骨間葉系幹細胞 (Prx1Cre;KLfl/fl) における Klotho の欠失、および骨細胞 (Dmp1Cre;KLfl/fl) では、両方とも破骨細胞吸収パラメーターが減少する傾向を示しました。11,27

OsxCre;KLfl/fl マウスの全体的な歯槽骨体積は相対的に増加しました。 これは、破骨細胞形成が著しく抑制されたためであり、骨形成の減少を上回った。 この骨形成と骨吸収の不均衡により、最終的には、OsxCre;KLfl/fl マウスの歯槽骨体積が予想外に増加しました。 この所見は、低代謝回転を伴う kl/kl マウスにおける海綿骨体積の増加を示した他のいくつかの観察結果と一致しています 28。 3 週齢では、Klotho 欠失は歯槽骨体積に有意な影響を与えなかったが、骨芽細胞と破骨細胞の数の減少。 これは、分析したマウスの年齢が若く、マウスが成体段階に進むにつれて表現型が時間の経過とともに発達したためである可能性があります。

正常な成人の骨の恒常性は、骨芽細胞と破骨細胞の活性のバランスに依存しています29。骨芽細胞の主な役割は骨基質を沈着させることですが、破骨細胞の分化と単球前駆体からの活性化は調節されています。部分的には、骨芽細胞によって分泌される Rank1 と Opg の間のバランスによるものです。31 我々の結果と一致して、OsxCre;KLfl/fl マウスでは Rank1 発現の減少が観察されました。 骨芽細胞と破骨細胞の共培養は、Rankl発現の低下を伴うKlotho欠損骨芽細胞がin vitroで破骨細胞形成を刺激できないことを示唆している。 これは、変異体で観察された骨吸収の減少が、Osx+間葉系前駆細胞におけるKlothoの機能的欠失の直接の結果であることを示している。 破骨細胞特異的な Klotho も Rankl 誘導性の破骨細胞形成を促進しましたが、26 OsxCre;KLfl/fl マウスでは、Osx+ 前駆細胞では Klotho が条件的に除去されましたが、破骨細胞では除去されませんでした。これは、Klotho が骨芽細胞依存性の骨吸収に少なくとも部分的に関与していることを示唆しています。骨芽細胞におけるランクルの調節による。 骨髄間葉系幹細胞では、RANKL が RANK に結合すると、RANKL シグナル伝達が活性化され、骨芽細胞の分化が負に制御されることが示唆されています 32。我々は、OsxCre;KLfl/fl マウスにおける骨形成の減少は、主に他の骨形成因子の発現の抑制によって引き起こされると提案しています。関連する要因。 OsxCre;KLfl/fl マウスの Osx+ 細胞における Rank1 発現は、破骨細胞形成の媒介に必須です。

この研究のもう1つの興味深い発見は、正常な生理学的状態で見られる破骨細胞形成の抑制にもかかわらず、OsxCre;KLfl/flマウスでは炎症関連の骨量減少および外傷性骨損傷に関連して骨吸収が活性化されていることである。 破骨細胞数とRankl/Opgレベルが尿毒症炎症中のPrx1Cre;KLfl/flマウスでより高かったことは注目に値し27、間葉前駆細胞のKlothoが病的状態下で破骨細胞形成を媒介する可能性があることを示している。 根尖性歯周炎は破壊的な骨の病理であり、抜歯骨の治癒は再生プロセスですが、どちらも炎症の調節に関与しています。 33 根尖性歯周炎では、慢性炎症が TNF-α および NF-κB シグナル伝達経路を刺激し、破骨細胞の分化と細胞の活性化を引き起こします。骨吸収。34 抜歯創傷の治癒プロセスは、炎症、修復、リモデリングの各段階で構成されており、炎症は治癒への極めて重要な最初のステップです。35 これは、外傷や細菌による損傷に反応して、抜歯直後に起こります。36 TNF-α、インターロイキン-1、インターロイキン-6、モチーフケモカイン 2 (CCL2) などのサイトカインは、炎症段階で高度に発現します 18。特に、炎症誘発性サイトカイン TNF-α は炎症段階で重要な役割を果たします。骨の吸収と骨の治癒。 骨髄間質細胞、骨芽細胞、および骨細胞における Rank1 産生を増強することにより、破骨細胞形成を刺激します 37。TNF-α は、TNFR I および TNFR II の 2 種類の受容体に結合することによって細胞シグナル伝達を活性化します。38 TNFR I は、生物学的作用の大部分を媒介すると考えられています。 TNF-α の機能を担っており、骨系列細胞における Rank1 合成に関与しています 39。

この研究では、Osx+間葉前駆細胞におけるKlothoアブレーションが、変異マウスと対照マウスにおけるより高い内因性Tnf-αおよびIl-6発現レベルと同時にTNFR I発現を上方制御することを見出した。 GO 分析により、Klotho 切除時の炎症経路の上方制御がさらに確認されました。 一方、骨芽細胞で Klotho を過剰発現させると、転写レベルとタンパク質レベルの両方で TNFR I 発現が抑制されました。 さらに重要なことに、KlothoとTNFR Iの直接結合により、Klothoは、TNF-α投与によって誘導されるNF-κBの核移行とそれに続くRank1発現の誘導を減少させ、細胞レベルでの骨芽細胞におけるKlothoの抗炎症機能を示した。 これは、根尖性歯周炎および外傷性損傷の条件下で、OsxCre;KLfl/fl マウスで観察される破骨細胞形成の増加を説明できる可能性があります。 口腔環境中の複雑な微生物群集が歯槽骨の恒常性と修復に影響を与える可能性があるため、炎症下での Klotho の機能は臨床応用にとって非常に重要です。40 OsxCre は、前駆細胞、つまり骨芽細胞および骨細胞内の Klotho を削除するために使用されました。 この主要な骨細胞集団における Klotho の欠如は、TNFR I の阻害の失敗を引き起こし、これにより炎症誘発性 Rank1 産生が加速され、最終的に骨吸収の上方制御につながりました。 TNF-α はまた、破骨細胞運命に向けてマクロファージの分化を増加させるために直接作用します 41。生体内での炎症部位におけるこれらの細胞の存在も Rank1 応答に寄与する可能性を排除することはできません。 今後の研究において、間葉系前駆細胞-Klothoが免疫細胞において間接的な調節役割を果たしているかどうかを明らかにすることは興味深いであろう。

Klotho の抗炎症機能は、腎臓、内皮、膵臓、末梢血などの他の部位でも以前に報告されています 42,43。Klotho を欠くマウスは、腎疾患を患う動物において炎症性損傷の増強を示します。44 対照的に、Klotho の外因性補充は、 Klotho または Klotho トランスジェニック発現は、これらの炎症に関連する腎病理学的プロセスを救済することができます 45 さらに、Klotho は単球のリポ多糖に対する炎症反応を軽減しました 46 内皮細胞では、Klotho は接着分子と NF-κB 発現を減弱させることにより炎症プロセスと関連している可能性があります。 .43 これらの観察は主に、選択的スプライシングまたは膜結合型 Klotho の細胞外ドメイン脱落によって生成される可溶型 Klotho の機能に起因すると考えられます。 TNFR I に対する負のフィードバック。膜結合型または可溶型の Klotho タンパク質がこの効果において優勢であるかどうかについては、さらなる調査が必要です。

ヒト組織における Klotho の細胞発現パターンに関する基本的な理解は、ほとんど解明されていないままです。 これまでの研究では、ヒト腎臓、副甲状腺、末梢血、腹膜単球、心筋細胞、結腸癌組織、およびいくつかのヒト組織由来細胞からの免疫蛍光染色により、細胞質および膜結合型クロトーの両方が検出されています48。人間の骨組織における内因性クロトーの遺伝子とタンパク質の両方の発現の存在。 その発現は骨芽細胞および骨細胞の細胞膜および細胞質に限定されており、これはその一般的な発現パターンに従っています。 クロトーの核機能について言及している研究は限られています。 ドイツ人ら。 脳の脈絡叢細胞とプルキンエ細胞の核膜付近に豊富なクロトーが存在することを発見した[49]。注目すべきことに、私たちの研究では、クロトーが炎症などの外部刺激に応答して核機能を持っている可能性があることを観察しました。 いくつかの証拠がこの教義を裏付けています。 まず、根尖性歯周炎患者では、Klotho の発現パターンが劇的に変化しました。 疾患が存在するヒトとマウスの両方で、Klothoタンパク質は核内に移行し、これに伴ってKlotho遺伝子の転写が増加した。 病的状態における歯槽骨における Klotho 発現の上方制御は、炎症に関連した骨吸収を阻害することによる保護効果がある可能性があります。 第二に、ChIP アッセイにより、Klotho が TNF-α によって核移行が誘導され、Rank1 遠位調節要素に結合することが確認されました。 さらに、R-7050はTNF-αによるRank1の刺激を遮断したが、TNF-αおよびR-7050処理下の対照細胞と比較して、Klothoで切除した骨芽細胞ではより高いRank1発現が検出され、抑制におけるKlothoの観察された核機能が強調された。ランクル。 これらのデータは、膜結合タンパク質として以前認識されていた機能を超えた、Klotho の潜在的な役割を強調しました。

結論として、我々は、Osx + 間葉前駆細胞における Klotho の特異的欠失が下顎歯槽骨の形成と骨吸収を減少させ、歯槽骨量の増加につながることを実証しました。 われわれは、Klotho欠損骨芽細胞では、破骨細胞形成の抑制に関与するRanklの発現が少ないことを発見した。 さらに、炎症に関連した骨修復中の骨形成は、Klotho欠損骨芽細胞では減弱します。 興味深いことに、Klothoはマウスおよびヒトの歯槽骨リモデリング中に活性化され、骨芽細胞系列細胞におけるTNF-α誘導性Rank1発現を阻害し、破骨細胞形成を間接的に媒介するように機能する。 これらの発見は、下顎歯槽骨の発達と修復を仲介する間葉前駆細胞発現 Klotho の新規の生理学的および病理学的機能を明らかにします。

すべての動物実験は、四川大学口腔疾患国家重点研究所の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールを使用して実施されました。 ヒトの根尖周囲の外科標本は、すべての患者が研究への参加と生体組織の使用についてのインフォームドコンセントフォームに署名したときに収集されました。 この研究は、四川大学西中国口腔科病院の倫理委員会によって審査され、承認されました。

Floxed Klotho および OsxCre マウスは以前に記載されています。50 匹の B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J マウスを Jackson Laboratory から購入しました。 Cre-LoxP 組換えシステムを使用して、Klotho 条件付きノックアウトマウスを生成しました。 KLfl/fl マウスを OsxCre マウスと交配させて、OsxCre;KLfl/+ マウスを生成しました。 次に、OsxCre;KLfl/+雄マウスをKLfl/+雌と交配させて、OsxCre(対照)およびOsxCre;KLfl/fl(変異体)マウスを作製した。

ヒトの根尖病変からの骨標本は、根尖周囲 (AP) グループとして使用するために歯内療法中に収集されました。 対照骨サンプルは、下顎骨切り術中に歯槽骨の正常領域から採取されました。 全RNAの抽出と組織学的検査のためにサンプルを収集しました。

P0 マウスの皮を剥ぎ、95% エタノール中で固定しました。 アリザリンレッドSおよびアルシアンブルー染色は、軟骨および石灰化組織の分析のために実行されました。 生後 3 週目および 11 週目のマウスの下顎骨と上顎骨を 4% パラホルムアルデヒドで一晩固定し、処理する前に 70% エタノール中で 4 °C で保存しました。 サンプルは、50 kV、200 μA で動作するμCT スキャナー (μCT50、Scanco、スイス) を使用し、露光時間 300 ms、ピクセルあたり 7.0 μm の解像度でスキャンされました。 画像は三次元形式で再構成されました。 関心領域は、正常な歯槽骨の下顎第一大臼歯の根分岐部、根尖性歯周炎モデルの根尖の 1/3 レベル、および抜歯モデルの上顎第一大臼歯の近心根窩から選択されました。 骨関連パラメータを測定して、歯槽骨の質と病変面積を分析しました。

固定サンプルを 20% EDTA (pH 7.5) で脱灰し、パラフィンに包埋し、HM360 ミクロトーム (Microm) を使用して 5 μm の切片に切断しました。 組織形態を評価するために、ヘマトキシリン (VWR) およびエオシン (Sigma-Aldrich) 染色を実行しました。 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ (TRAP) (Sigma) を使用して、メーカーのプロトコールに従って破骨細胞を検出しました。 免疫蛍光染色では、抗原賦活化のためにスライドを 95 °C のクエン酸ナトリウム緩衝液に 20 分間さらし、0.5% Triton X-100 (Beyotime) で 10 分間透過処理し、5% BSA で 1 時間ブロックしました。 スライドを、Anti-Runx2 (1:200、Abcam、ab23981)、Anti-GFP (1:50、Santa Cruz、sc-9996)、Anti-RFP (1:50、Santa Cruz、sc-390909)、抗-Klotho (1:100、R&D、AF1819)、抗 Klotho (1:100、Santa Cruz、sc-515939)、または抗 Rankl (1:100、R&D、AF462) 抗体を 4 °C で一晩、蛍光標識二次抗体、Alexa Fluor 488 または 568 (Invitrogen、1:1000) を室温で 1 時間反応させます。 核をDAPI (Vector)で対比染色した。 画像は、オリンパス共焦点顕微鏡 FV3000 (オリンパス) で取得しました。

生後 21 日 (P21) のコントロールおよび変異マウスの下顎骨を使用して、トータル RNA を抽出し、RNA-seq で分析しました。 配列決定ライブラリーは、NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB、USA) を使用して生成し、インデックス コードを追加して配列を各サンプルに関連付けました。 ライブラリー調製物は、Illumina Hiseq プラットフォーム上で配列決定されました。

生後 8 週目のマウスを使用して、前述のように根尖性歯周炎および抜歯モデルを作成しました。 マウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔した。 根尖性歯周炎モデルでは、高速ハンドピースを使用して右下顎の第一大臼歯を開きました。 実体顕微鏡 (Leica) の下で #10 歯内療法用 K ファイルを使用して根管を検査しました。 歯髄室を口腔に 3 週間曝露した。 対側の第一大臼歯を対照として使用した。 抜歯モデルは、実体顕微鏡下で 26 G の注射針と鉗子を使用して抜歯した右上顎第一大臼歯を使用して作成されました。 出血を止めるために穏やかな圧力が加えられました。 マウスには手術後 3 週間軟食を与え、屠殺しました。

Klothoを過剰発現するMC3T3細胞を100 mmディッシュで培養し、全細胞溶解アッセイ（KeyGEN）によってホモジナイズしました。 タンパク質濃度は、強化されたBCAタンパク質アッセイキット(Beyotime)によって測定した。 免疫沈降は、プロテインA/G PLUS-アガロース免疫沈降試薬(Santa Cruz、sc-2003)を用いて、製造業者のガイドラインに従って実施した。 次に、サンプルを NuPAGE LDS サンプルバッファーおよび NuPAGE 還元剤 (Life Technologies) を使用して 70 °C で変性し、プレキャストゲル (Invitrogen) を使用して NuPAGE 4 ～ 12% Bis-Tris SDS/PAGE で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜 (Millipore) に転写しました。 。 1時間のブロッキング後、膜を抗KLOTHO抗体(1:1000、Cosmo Bio、KM2076)または抗TNFR I抗体(1:1000、Abcam、ab223352)とともに一晩インキュベートした。 ヤギ抗ラット/ウサギ IgG 二次抗体 HRP 結合 (1:5000、Signalway 抗体、L3012 および L35027) を使用し、増強化学発光キット (Bio-Rad Laboratories) によって検出しました。

すべてのデータは平均値 ± SEM として表されます。 統計解析には、GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc.)を使用した。 2 群の比較は対応のない両側スチューデント t 検定によって評価され、多重比較は一元配置分散分析 (ANOVA) またはボンフェローニ事後検定を使用した二元配置分散分析によって実行されました。 P 値 <0.05 は、すべての分析で有意であるとみなされました。

カルセイン二重標識、血清測定、細胞培養、トランスフェクション、免疫細胞化学、RNA 単離、qRT-PCR 分析、ChIP アッセイに関する拡張方法と情報は、補足資料と方法に記載されています。

現在の研究のデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、NSFC助成金81800928、81901040、および82171001、CASTによる若手エリート科学者スポンサーシッププログラム（番号2020QNRC001および2018QNR001）、四川省科学技術プログラム（番号2019YJ0054）、西中国学校/病院からの研究資金によって支援されました。四川大学口腔病学の博士号（番号 RCDWJS2021-1）、口腔疾患の国家重点研究所オープンファンディング助成金 SKLOD202114。

これらの著者は同様に貢献しました: Yi Fan、Chen Cui。

国家口腔疾患重点研究所、国立口腔疾患臨床研究センター、虫歯学および歯内療法部門、西中国口腔病学病院、四川大学、610041、成都、四川、中国

Yi Fan、Chen Cui、Ruoshi Xu

中山大学広華口腔科病院、広東省口腔病学重点研究所、510055、広州、広東省、中国

チェン・クイ＆シー・ウェイ

Maine Medical Center Research Institute、スカボロー、メイン州、04074、米国

クリフォード・J・ローゼン

内分泌部門、マサチューセッツ総合病院、ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、02215、米国

Tadatoshi Sato

国立口腔疾患臨床研究センター、口腔疾患国家主要研究所、四川大学西中国口腔科病院、顎関節・顎関節外科部門、610041、成都、四川、中国

ペイラン・リー＆ルイエ・ビ

国家口腔疾患重点研究所、国立口腔疾患臨床研究センター、口腔インプラント科、西中国口腔病院、四川大学、610041、成都、四川、中国

クアン・ユアン

国家口腔疾患重点研究所、国立口腔疾患臨床研究センター、矯正歯科、西中国口腔病院、四川大学、610041、成都、四川、中国

周チェンチェン

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CZ、QY、YF がこの研究を発案し、すべての実験を計画しました。 YF、CC、CZ、QY、CJR が原稿を書きました。 YF、CC、ST、RX、PL、XW、RB が実験を実行し、データを分析しました。 すべての著者が記事を読んで承認しました。

Quan Yuan または Chenchen Zhou との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Fan, Y.、Cui, C.、Rosen, CJ 他 Osx+間葉前駆細胞のKlothoは、下顎歯槽骨の形成と修復中に骨形成促進効果と抗炎症効果を発揮します。 Sig Transduct Target Ther 7、155 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41392-022-00957-5

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受信日: 2021 年 12 月 13 日

改訂日: 2022 年 3 月 3 日

受理日: 2022 年 3 月 6 日

公開日: 2022 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-022-00957-5

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整形外科および研究ジャーナル (2023)