ERK1/2 はらせん切断における祖先の組織化シグナルです

Nature Communications volume 13、記事番号: 2286 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

動物の発生は、細胞の運命が誘導シグナルによって指定されるか、母性決定因子によって指定されるかに基づいて、それぞれ条件付きまたは自律的に分類されます。 しかし、これら 2 つの主要な発達様式がどのように進化したのかは依然として不明です。 螺旋卵割（軟体動物や環形動物を含む 15 の無脊椎動物グループの祖先である定型的な胚発生）中、ほとんどの系統は条件付きで細胞運命を指定しますが、一部の系統は一次軸運命を自律的に決定します。 この変化を引き起こすメカニズムを特定するために、我々は、早期に分岐する条件付き環形動物である Owenia fusiformis を研究します。 オーウェニアでは、ERK1/2 媒介 FGF 受容体シグナル伝達によって内内胚葉前駆細胞が特定されます。 この細胞はおそらくオーガナイザーとして機能し、隣接する細胞に中胚葉および後背葉の運命を誘導し、前方化シグナルを抑制する。 オーウェニアにおけるERK1/2の組織化の役割は軟体動物と共有されているが、自律環形動物とは共有されていない。 これらの発見を総合すると、ERK1/2+ 胚オーガナイザーの条件的指定はらせん卵割の祖先であり、自律発生を伴う環形動物系統では繰り返し失われていたことが示唆される。

より限定された発生運命（内胚葉、神経外胚葉、中胚葉など）への最初の胚細胞のコミットメントは、動物の胚形成における極めて重要なステップであり、身体計画の確立につながり、その後の発生に影響を与えます1、2、3。 この初期の空間構成を定義するために、動物の胚は、条件付きの誘導的な細胞間相互作用と、細胞自律的な母性決定基の非対称遺伝を組み合わせています1,2,4。 多くの場合、これらの発生戦略のいずれかが優勢であるため、動物の胚発生は条件付きまたは自律的と定義されます 1,2,4。 進化の過程で、動物の系統は細胞運命の仕様に関するこれら 2 つの主要なモードの間で移行してきました 5。 しかし、これらの発生遷移がどのように起こるのかは不明である。なぜなら、それらは初期胚発生におけるさらなる変化（例えば、卵割パターン6,7）と一致することが多く、細胞運命仕様の変化の原因を特定することを困難にするからである。

らせん卵割は、軟体動物や環形動物を含むSpiralia内の無脊椎動物群で見られる、4細胞期以降の交互の斜め細胞分裂を特徴とする古くからある典型的な初期発生プログラムです8,9（図1a）。 らせん状の裂開胚は、それぞれ体の左側、腹側、右側、背側にほぼ対応する A ～ D と名付けられた 4 つの胚の四分円の周りに細胞運命を組織します 8,9。 らせん状の卵割は教科書の自律発生の例として描かれることが多い 2,4 が、らせん状の卵割をする胚は、卵割プログラムと胚細胞系統の全体的な保存に影響を与えることなく、条件付きまたは自律的に軸方向のアイデンティティを指定します 8,9,10 (図 1)。 1b)。 細胞運命指定の条件付きモードでは、動物の極の細胞と、約 32 ～ 64 細胞期の 1 つの植物割球との間の誘導シグナルによって、後者は背側 D 運命に関与します 11。 この細胞は胚の組織者として機能し、隣接する細胞に特定の運命に向けて指示し、動物の体の計画を確立します（図1b）。 この螺旋状の切断様式は広く普及しており、Spiralia の祖先である可能性が最も高い 11、12、13 (ただし、代替仮説については Dohle を参照 14) (図 1c)。 しかし、一部の軟体動物および環形動物の系統 11,12 は、4 細胞期の胚における 1 つの割球への母性決定基の非対称分離を通じて軸方向の同一性を特定します 15,16,17 (図 1b)。 この割球は背側 D 運命を採用し、その後その子孫の 1 つが胚形成者として機能します。 したがって、らせん裂開動物における条件的発生モードと自律的発生モードの両方の存在12は、動物の胚における細胞運命仕様の遷移を支える細胞機構および分子機構を同定するための理想的なシステムである。 しかし、らせん切断を制御する機構、ひいては発生モードのスイッチはほとんど理解されていない。

a 螺旋卵割は、左右対称の動物（Bilateria）の 3 つの主要な系統の 1 つである Spiralia（カタツムリや分節虫など）の祖先である定型的な発生様式です。 らせん状の切断は、4細胞期以降、動物の植物軸に沿って交互に起こる斜めの細胞分裂(赤い矢印)によって特徴付けられます。 b らせん状の切断胚は、条件付きまたは自律的に軸方向のアイデンティティと胚オーガナイザーを指定します。 条件付きモードでは、後背側アイデンティティ（D象限、Dで表される）と胚オーガナイザーの指定は、誘導シグナルを通じて卵割の後期（種に応じて約32〜64細胞期）に起こります。 しかし、細胞運命指定の自律モードは、既に 4 細胞期 (D を持つ細胞) で D 象限を指定する、異なって分離された母性因子 (赤い点) に依存しています。 卵割の後半では、おそらくこれらの母性因子の一部を受け継いでいる D 象限の 1 つの細胞が胚形成者として機能します。 c 条件付きモードは螺旋へき開を示すすべての螺旋系統で見られ、自律モードは軟体動物と環形動物でのみ観察され、条件付き仕様が祖先のものであることを示唆しています。 条件付き自律軟体動物はMAPキナーゼERK1/2を使用して身体計画を確立しますが、研究されているすべての自律環形動物はこのシグナル伝達カスケードに依存しておらず、軟体動物と環形動物以外の知識は存在しません。 したがって、螺旋へき裂を制御する祖先の機構は依然として不明であり、それがスピラリアの進化に関する我々の理解を制限している。 条件付き環形動物 Owenia fusiformis は、残っているすべての環形動物の姉妹系統のメンバーとして、環形動物とスピラリア全体の祖先の発生形質を推測するのに役立ちます。 図面は縮尺通りではありません。

ERK1/2 シグナル伝達経路（進化的に保存されたキナーゼの細胞内カスケード 18）は、軟体動物の背側 D 象限のアイデンティティを指定し、組織化活性を制御します（図 1c、補足表 1）。 多くの条件付き軟体動物では、誘導相互作用により、背側 D 運命を採用し、胚形成機構として機能する割球内の ERK1/2 が活性化されます 19,20,21,22,23 が、その細胞の系統同一性は種によって異なります (補足表 1)。 同様に、活性型ジリン酸化 ERK1/2 は、自律的な軟体動物 Tritia obsoleta 17 の胚形成機構 24 として機能する D 象限割球に必要です。 しかし、環形動物では、自律種はERK1 / 2活性の多様なパターンを示し、背側D象限と胚オーガナイザーを特定するためにこのシグナル伝達経路を必要としません25、26、27、28（図1c;補足表1）。 しかし、らせん切断中のERK1 / 2の役割は、条件付き環形動物および他のほとんどのらせん状グループについては不明です（図1c）。 これにより、環形動物およびスピラリア一般の体のパターン形成を制御する祖先のメカニズムを推測することができなくなります（図1c）。したがって、ERK1 / 2の軸組織化の役割が軟体動物の革新によるものなのか、それとも何らかの自律神経系で失われた祖先の細胞運命指定メカニズムであるのかは不明です。環形動物の系統。

この研究では、条件付き環形動物におけるERK1/2シグナル伝達の役割を決定するために、Owenia fusiformis種29,30を戦略的に研究しました（図1c）。 この海洋種は、残りすべての環形動物の姉妹群であるオウェニーダに属し、環形動物の祖先と考えられる胚形質を示します 30、33。 したがって、O. fusiformis の研究は、他の環形動物および螺旋綱と比較することにより、このグループおよび螺旋綱一般の祖先形質を推測するのに役立ちます。

母性決定因子を受け継ぐ D 系統の割球が大きい自律的な発生様式を持つ種とは異なり、条件付き螺旋卵割様式を持つ胚の 4 つの胚の四分円は対称的であり、これが発生初期における細胞の同一性の推測を妨げます。 しかし、D 象限で胚形成機構として機能する細胞は、A ～ C 象限の同等の割球と比較して細胞周期の進行を遅らせ、一部の条件付き軟体動物では活性型 (つまり、二リン酸化された) ERK1/2 の濃縮を示します 10,20推定では条件付き環形動物 Hydroides hexagonus20 (図 1c)。 したがって、D 系統を決定し、O. fusiformis の潜在的な胚形成者を同定するために、我々はまず、受精から原腸形成の開始まで (受精後 6 時間、hpf) の植物極における細胞分裂の動態と ERK1/2 活性のパターンを特徴付けました。 ）。 この環形動物では、最初の切断非対称は、〜4 hpfでの4番目のミクロメアカルテット（4q細胞）の出現により発生します。このとき、4q細胞のペアが他の2つよりも前に形成されます（補足図1a、b）。 それでも、植物極は対称のままであり、胚の象限のアイデンティティは5 hpfでは識別できません（体腔芽細胞期、補足図1c）。 ただし、6 hpf30で原腸形成が始まると、4q割球の1つを除くすべてが分裂します（補足図1d）。 この段階では、分割されていない4q細胞はより大きく、7 hpfでの初期原腸形成中の進入後に2つの大きな細胞にのみ切断されます（補足図1e、f）。 したがって、O. fusiformis における左右対称の最も初期の形態学的兆候は、1 つの 4q ミクロメアの形成と分裂の遅延によって起こり、これは、4q 割球の分裂と進入の同様の動態を持つ他の条件環形動物の 4d 細胞であると推測されます。 、36、37。

ERK1/2 活性のパターンと O. fusiformis の 4q ミクロメアとの関係を分析するために、我々は ERK1/2 の活性ジリン酸化型 (di-P-ERK1/2)20 に対する交差反応性抗体を使用しました。受精から左右対称性と分割されていない 4q ミクロメア (6 hpf) の開始まで。 この環形動物には、活性卵母細胞で低レベルで発現される単一のERK1 / 2オルソログがあり、その発現と活性が増加するときは最大4 hpf（〜32細胞期）になります（補足図2a〜d）。 この時点で、4つの最も動物/頂端のミクロメアは濃縮されたdi-P-ERK1/2シグナルを示します（図2a、b;補足図2c）。これは、di-P-ERKが濃縮されると5 hpfで消失します。代わりに1つの4qミクロメア（図2c、d;補足図2c）。 6 hpfでは、di-P-ERK1/2シグナルは、2番目のカルテットの3対のミクロメアと、卵割を7 hpfまで遅らせて胚の四放射対称性を破る4qミクロメアを含む7つの割球で濃縮されます（図1）。 2e、f;補足図2c）。 まとめると、私たちのデータは、ジ-P-ERK1 / 2がO. fusiformisの5および6 hpfで4qミクロメアを濃縮し、7 hpfになるまで切断を延期する4d細胞（図2g）を裏付けており、環形動物で観察された条件と似ていますH. hexagonus20 および多くの腹足類軟体動物 19、20、21、22、24。

活性型ジリン酸化ERK1/2（ジ-P-ERK1/2；黄色）に対して染色した受精後4、5、6時間（hpf）のホールマウント胚のa-f zスタック投影。核（DAPI）。 4 hpf (a、b) では、di-P-ERK1/2 は 4 つの動物細胞 (1q111) に濃縮されます。 5 hpf（c、d）では、di-P-ERK1 / 2シグナルは単一細胞（4dミクロメア、補足図1を参照）にありますが、活性型ERK1 / 2は2a〜c系統の6つの細胞で発生し、 6 hpf の 4d セル (e、f)。 a〜fの挿入図は、対応するスタックの明視野画像です。 g O. fusiformis の誕生時の植物極と第 4 ミクロメア カルテットの最初の分裂の概略図。 赤色は、濃縮された di-P-ERK1/2 シグナル。 d と f では、アスタリスクは動物の極を指します。 a ～ f の説明は、少なくとも 2 つの生物学的複製からの、ステージごとに少なくとも 10 個の胚に基づいています。 スケールバーは50μmです。 g の図面は縮尺通りではありません。

O. fusiformis の発生における ERK1/2 シグナル伝達の役割をさらに調べるために、我々は、他のらせん状切断胚におけるオーガナイザーの誘導をブロックするために以前に使用されていた細胞内タンパク質輸送の阻害剤であるブレフェルジン A (BFA) で胚を処理しました。 38、および MEK1/2 および ERK1/2 の二リン酸化の選択的阻害剤である U0126 24,39 (図 3a)。 どちらの薬物でも、ジ-P-ERK1 / 2が4dで濃縮されている場合、受精（〜0.5 hpf）から5 hpfまでの治療は、ERK1 / 2の活性化を効果的にブロックします（図3b、補足図3a、補足表2）。そして、10μMの濃度で胚の最大100％まで、用量依存的に左右対称性、後部構造（例、毛虫および後腸）および幼虫の筋肉の喪失を引き起こします（図3c;補足図3b;補足表） 3と4）。 対照サンプルと比較して、0.5 ～ 5 hpf 処理胚は完全に形成された頂端房および頂端器官を欠いており、頂端器官マーカーの外胚葉発現が減少していることと、神経マーカー シナプトタグミン-1 (syt1) 陽性の頂端細胞の数が少ないことが示されています30 (図3d）。 さらに、処理された胚は、後腸（cdx）および幹中胚葉（ツイスト）マーカーの発現を欠いており、単一腸開口部の周囲で口腔外胚葉マーカー遺伝子gsc3の発現の拡大を示し（図3d;補足図3c）、中腸内胚葉マーカー GATA4/5/6b3 (補足図 3c)。 我々は、この表現型を前腹側放射状（または放射状、補足表3）とみなします。 したがって、O. fusiformis の胚発生中に後部および背側構造を特定し発達させるには、体腔芽胞期の 4d 細胞における ERK1/2 シグナル伝達の活性化が必要であるが、1q111 における ERK1/2 活性の阻害（4 hpf で）も寄与する可能性がある頂端器官の表現型が減少します。

a ERK1/2 シグナル伝達カスケードとブレフェルディン A (BFA) および U0126 の作用機序の概略図。 b di-P-ERK1/2 に対するホールマウント免疫染色（メインパネルは側面図、挿入図は植物図）。 受精後 0.5 時間 (hpf) から 5 hpf までの BFA および U0126 処理は、4d 細胞における di-P-ERK1/2 の濃縮を防ぎます。 c 0.5〜5 hpfで処理した対照およびBFA/U0126 24 hpf幼虫の横方向のZスタック投影。 処理された胚の挿入図は腹側から見た図です。 繊毛は抗アセチル化チューブリンで標識され、F-アクチンはファロイジンで標識されています。 d 対照およびU0126処理（0.5〜5 hpf）幼虫でのホールマウントin situハイブリダイゼーション。 e 分析された薬物治療ウィンドウの概略図。 ケースの数は、時間間隔を指定する各バーの右側に表示されます。 f 各ウィンドウおよび実験条件で観察された幼虫表現型の分布とパーセンテージ (WT、野生型; R、放射状)。 g 0.5 hpfから3〜4 hpfまでのBFA処理後に得られた圧縮幼虫表現型の表現型の特徴。 最初の列、DAPI (核)、ファロイジン (F-アクチン)、およびアセチル化チューブリン (繊毛) で染色した幼虫の側面 Z スタック投影。 下の行、頂端外胚葉 (six3/6)、口腔外胚葉 (gsc)、後腸 (cdx) および中胚葉 (ツイスト) マーカーに対するホールマウント in situ ハイブリダイゼーションの側面図。 圧縮された幼虫は正常ですが、頂端器官が減少しており、幼虫の胚盤胞が何らかの形で消失しています。 b ～ d および g では、アスタリスクは頂端極を指します。 b については、補足表 2 に詳細な数値を報告します。 c〜dおよびgについては、補足データ1に詳細な数値が報告されています。 e および f については、補足表 5 に詳細な数値が報告されています。 概略図は縮尺通りではありません。 ao 頂端器官、肛門、ch チャエテ、mg 中腸、mo 口、pt プロトトロク。 スケールバーは50μmです。

O. fusiformis の卵割中の ERK1 / 2 の誘導と活性の正確なタイミングを分析するために、受精から初期の原腸形成までの重複する時間枠で胚を 10 μM BFA / U0126 で処理しました（図 3e、f; 補足表 5）。 受精から 8 細胞期までのタンパク質分泌を BFA でブロックしても、正常な発育には影響しません。 しかし、8細胞期と4hpfの間のBFA処理では、典型的な僧帽弁の幼虫のすべての形態的ランドマークと組織特異的マーカーの正常な発現を備えた幼虫が得られますが、おそらく心尖腹軸に沿って圧縮された形態を持っています。幼虫の胚盤胞の形成障害（図3g、補足図3c）。 4〜6 hpfのBFAによる治療のみ、したがって4dの形成に及ぶ場合は放射状表現型を引き起こし、5 hpf以降の治療は致死的です（図3e、f;補足図3c）。 これらすべては、4dのERK1 / 2の活性化を引き起こす潜在的な誘導イベントが、4qのミクロメア形成中に4〜5 hpfの間で起こるはずであることを示唆しています（補足図1a〜c）。 予想外なことに、2細胞期からこの誘導イベントが始まる可能性がある4hpfまでU0126によるERK1 / 2ジリン酸化を防止すると、放射状表現型も引き起こされます（図3e）が、特定の時点間でわずかな違いがあります（補足図） .2c)。 したがって、ERK1/2 活性は、O. fusiformis のほとんどのらせん状卵割を通して、正常な胚のパターン形成と後背側の発達に不可欠です。 しかし、BFA と U0126 の表現型の組み合わせは、ERK1/2 が 2 細胞期から 4 hpf まで自律的に作用する可能性があることを示唆していますが、ERK1/2 は細胞内タンパク質輸送を必要とし、したがって誘導性の細胞間通信シグナルを必要とする可能性があります。 4D でのエンリッチメント。

ERK1/2 が O. fusiformis の後背背発達を制御するメカニズムを調べるために、我々は次に、BFA および U0126 処理胚における遺伝子発現のゲノムワイドなプロファイリングにより、ERK1/2 活性の上流制御因子と下流標的が明らかになると仮説を立てました。 そこで我々は、受精から 5 hpf まで胚を 10 µM BFA または 10 µM U0126 で処理し（ERK1/2 活性の自律期と条件相の両方をカバーするため）、受精直後に収集した処理胚と制御胚で RNA-seq トランスクリプトーム プロファイリングを実行しました。 4d細胞（体腔芽細胞; 5.5 hpf）および幼虫段階におけるP-ERK1 / 2の濃縮（図4a;補足図4a、b）。 差次的発現解析により、BFA処理した体腔芽細胞と幼虫でそれぞれ90個と268個の差次的に発現した遺伝子（DEG、log2（変化倍数）<-1.5、偽発見率調整p値<0.05）、および132個（体腔芽細胞）と373個が明らかになった。 U0126処理後の（幼虫）DEG（図4b）。 すべての比較を考慮し、冗長性を削除すると、合計 628 個の DEG が検出され、そのうち 414 個（65.92%）には機能的に注釈が付けられ、転写、発生、および細胞運命の指定の制御に関連する遺伝子オントロジー用語が豊富でした（補足データ 2）。 これらのDEGのほとんどは下方制御されており（図4b、c、補足図4c、d）、両方の薬物および2つの発生時点で系統的に下方制御されているのは3つのDEG（cdx、fer3、およびfoxH）のみでした（図4b、補足図4c、d）。図4d)。 注目すべきことに、U0126とBFAの下流ターゲットは限られた重複を示しました（補足図4d）。これはおそらく2つの治療法の異なる特異性の結果であり、BFAは細胞内輸送とタンパク質分泌を幅広くターゲットしているため、U0126よりも多くのオフターゲット効果を示す可能性があります。 それにもかかわらず、我々のアプローチにより、その発現がERK1/2活性に強く依存している、信頼性の高い比較的小規模な遺伝子セットが明らかになった。

a RNA-seq コレクションの実験計画。 塗りつぶしのバーは、対照期間 (DMSO)、ブレフェルジン A (BFA)、および U0126 による治療を示します。 赤い丸は、体腔芽細胞（受精後 5.5 時間、hpf）および幼虫期（24 hpf）でのサンプル収集を示します。 b さまざまな条件および比較における差次的発現（DE）遺伝子の数（下部の白と灰色の点で示されます。灰色の点は比較に含まれる条件を強調表示します）。赤いバーは下方制御された遺伝子、青いバーは上方制御された遺伝子です。 c BFAおよびU0126で処理した体腔芽細胞の火山プロット（両側Wald検定）。 赤い点は DE 遺伝子を示し、比較ごとに候補遺伝子がラベル付けされています。 d 4dの誤った仕様によって影響を受ける候補遺伝子の発現の時間的および空間的時間経過。これらは一般に頂端/前部、毛嚢/後部、後腸、および中胚葉の発達に関連しています。 最初の列 (「条件」) は、各候補遺伝子が差次的に発現する処理 (BFA または U0126) および発生段階 (CB 体腔芽細胞、L 幼虫) を示します (各条件は異なる色で強調表示されます)。 中央のヒートマップは、各遺伝子の発現の正規化された Z スコア値を示します。 垂直の点線は 4d 仕様のタイミングを強調しています。 3 番目の列は、体腔芽細胞 (5 hpf)、原腸胚 (9 hpf) および幼虫期 (24 hpf) におけるこれら 22 個の候補遺伝子のサブセットのホールマウント in situ ハイブリダイゼーション画像を示しています。 e 候補遺伝子のうち 3 つだけ (cdx、foxH、および fer3) が、すべての段階および治療比較においてダウンレギュレートされます。 in situ ハイブリダイゼーションによる検証により、これらの遺伝子の発現が薬物治療後に失われることが実証されました。 d と e では、体腔芽細胞期と幼虫期の cdx の写真、対照条件は同じです。 dおよびeでは、アスタリスクは動物/頂端極を指し、矢印は発現ドメインを指します。 In d ヒートマップは、2 つの生物学的複製から生成された発生時間経過から生成され、in situ 発現は少なくとも 2 つの生物学的複製で行われました。 c および e については、補足データ 1 に詳細な数値が報告されています。 スケールバーは50μmです。 概略図は縮尺通りではありません。 bp ブラストポア、mo 口。

DEGが4dの誤った仕様の影響を受けていることを検証するために、特定の細胞および組織タイプのマーカーであるさまざまな転写因子（たとえば、six3/ 6、gsc、cdx、AP2、foxQ2）、中胚葉の発達（例、twist、hand2、foxH）および神経発生（例、POU4、irxA）に必要、Wntリガンド（wnt1、wntA、およびwnt4）、TGF-βモジュレーター（noggin）および BAMBI）、および Notch シグナル伝達コンポーネント（デルタおよびノッチ状）。 未受精卵母細胞から成熟幼虫までの 12 の発生時点 33 をカバーする段階特異的な RNA-seq データにより、すべての候補遺伝子の発現が 4d スペシフィケーションおよび di-P-ERK1/2 濃縮の時点または直後に上方制御されることが確認されました。このセル内です（図4d）。 これらの遺伝子は、頂端/前方ドメイン (noggin、BAMBI、foxQ2、POU4、six3/6、gsc)、幼虫後端および毛虫 (fer3、lhx1/5、wnt1、notch、msx2-a、irxA、AP2) のいずれかで発現します。 、wnt4、デルタ）、後腸（cdx）、または中胚葉誘導体（foxH、rhox、wntA、POU3、hand2、twist）（図4d;補足図5a〜g）。 体腔芽胚（5.5 hpf）および幼虫（24 hpf）段階の対照および処理胚におけるこれらの遺伝子の発現の分析により、これらの遺伝子の発現ドメインがBFAまたはU0126のいずれかで処理した後に消失することが確認されました（図4e;補足図5a）。 –g; 補足データ 1; 補足表 7)、したがって、RNA-seq アプローチを検証します。 まとめると、我々の発見は、ERK1/2シグナル伝達の下流で作用し、O. fusiformisの頂端、後背側、および中胚葉構造の発達に関与する一連の共調節遺伝子を明らかにした。

私たちの RNA-seq 研究と候補遺伝子スクリーニングにより、9 つの遺伝子が 5.5 hpf で植物極で発現し、その発現が ERK1/2 ジリン酸化の直接阻害 (cdx、delta、foxH、wnt1、wntA、rhox、fer3) のいずれかによって影響を受けることが明らかになりました。およびAP2）または細胞内タンパク質の輸送と分泌（gsc）を損なう（図4e;補足図5a、c、e）。 これらの遺伝子はいずれも、4dミクロメアにおけるERK1/2活性の開始時である5hpfでは発現されない（図5a）。 代わりに、発現がBFAおよびU0126処理の影響を受けない初期内胚葉マーカーGATA4 / 5 / 6a3は、この段階で腹板（4dを含む）で対称的に発現されます（図5a;補足図6a）。 4d における ERK1/2 シグナル伝達の最初の活性化から 30 分後の 5.5 hpf では、植物極は左右対称のパターンになりますが、ERK1/2 依存遺伝子のうち 2 つ（cdx と delta）のみが 4d ミクロメアで発現されます（図.5b、c)。 注目すべきことに、これらは他のらせん状胚の4d細胞で発現されており（補足表8）、したがって、細胞周期の進行、細胞の位置情報、およびERK1 / 2活性に基づいた細胞系統の推論を裏付けています。 ParaHox 遺伝子 cdx は、幼虫段階で O. fusiformis の後腸で検出されます 3 (図 4e、補足図 6b) は、4d で発現し、その後 4d の 2 つの娘細胞 (つまり、左側) で発現します。および右腸間膜芽細胞、またはMLおよびMR細胞）、これらは分裂せずに残り、原腸胚期まで活性di-P-ERK1 / 2を示し続けます（図6a、b;補足図1f）。 同様に、ノッチリガンドデルタ（補足図6c、d）は、5.5 hpfで4dで発現しますが、動物極の1dの子孫のほとんどに加えて、動物のミクロメアとC-およびD-の外胚葉誘導体でも発現します。植物極の象限（図5b、c;補足図5a）。 ERK1/2 が cdx と delta の活性化をどのように制御するかを調べるために、5 hpf でのシーケンシング (ATAC-seq) データを使用したトランスポザーゼにアクセス可能なクロマチンのアッセイを使用して、これら 2 つの遺伝子に関連するアクセス可能なクロマチン領域に存在する転写因子モチーフを同定しました (図.5d）。 これらには、ETS、RUNX、GATA 因子など、ERK1/2 リン酸化によって調節されることが知られている転写調節因子のモチーフが含まれます 18。 したがって、4dにおけるERK1/2の二リン酸化は、後運命を誘導する転写調節因子（cdx）および細胞間コミュニケーション遺伝子（デルタ）の活性を制御すると考えられる。

a、b それぞれ受精後5時間および5.5時間（hpf）で植物極をパターン化する遺伝子のサブセット（ERK1 / 2依存性および独立性）のホールマウントin situハイブリダイゼーション。 5 hpf (a) では、4d が指定されている場合 (左の図)、内胚葉マーカー GATA4/5/6a のみが発現します (4d セル、矢印を含む)。 5.5 hpf (b) では、cdx とデルタが 4d 細胞 (矢印) で発現し始め、4d 細胞を囲む C および D 象限ミクロメアが後背側および中胚葉の発生に関与する一連の遺伝子 (foxH、wnt1、wntA) を発現し始めます。 、rhox、fer3、AP2）。 ERK1/2 活性化によって直接調節されない前口腔外胚葉遺伝子 gsc も、この時点で発現され始めます (矢印)。 bでは、上の行は比色in situハイブリダイゼーションであり、下の行は核（DAPIによる）と細胞境界（アセチル化チューブリン免疫組織化学による）を対比染色した蛍光in situハイブリダイゼーションのZスタック投影です。 a と b では、すべてのパネルが植物ビューです。 a と b の説明は、少なくとも 2 つの生物学的複製からの、ステージごとに少なくとも 10 個の胚に基づいています。 c 4d割球の周囲のC象限とD象限の植物極とミクロメアの概略図。遺伝子発現ドメイン（緑色）と5.5 hpfでの研究遺伝子の推定細胞アイデンティティを示しています。 スケールバーは50μmです。 図面は縮尺通りではありません。

受精後 7 ～ 9 時間 (hpf) のジリン酸化 ERK1/2 (di-P-ERK1/2) に対するホールマウント免疫組織化学の Z スタック投影 (植物図)。 4dミクロメアは7 hpfで切断され、MRおよびML娘細胞になります（補足図1）。 b DAPI（核）とアセチル化チューブリン（細胞境界）で対比染色した、原腸胚期（9hpf）のcdx（黄色）に対する蛍光ホールマウントin situハイブリダイゼーションのZスタック投影（植物像）。 c 5 hpfでのcdx遺伝子座（上部）およびデルタ遺伝子座（下部）の周囲の開いたクロマチン領域でアクセス可能な転写因子モチーフの分布。 濃い青と明るい青は 2 つの ATAC-seq 複製を示しています。 d DAPI（核）、アセチル化チューブリン（細胞境界）およびホスホヒストン3（赤色、マーカー）で対比染色した、6～9 hpf（すなわち、原腸形成）に対するfoxHに対する蛍光ホールマウントin situハイブリダイゼーションのzスタック投影（植物像）。有糸分裂の）。 e 原腸形成中の4dおよびMR / MLを囲む細胞の概略図。dに基づくfoxHの発現を示します。 f 膜アクチンについて染色された8個の胚の分析に基づく、5.5 hpfでの4qミクロメアのそれぞれの細胞接触の数。 4d 細胞は、原腸形成の開始時に他の 4q ミクロメアよりも多くの細胞接触を確立します。 g DAPI (核) およびアセチル化チューブリン (細胞境界) で対比染色した、5.5 hpf での gsc および AP2 に対する蛍光ホールマウント in situ ハイブリダイゼーションの Z スタック投影 (植物像)。 すべての 4q ミクロメア (アスタリスク) が同様に動作するため、4d の誤った仕様は口腔外胚葉遺伝子 gsc を拡張し、後部遺伝子 AP2 の発現を損ないます。 gsc 発現はブレフェルディン A (BFA) 処理胚では失われており、これは誘導シグナルを必要とする可能性があることを示唆しています。 d および g では、矢印および矢頭は発現ドメインを指します。 a、b、および d の説明は、少なくとも 2 つの生物学的複製からの、ステージごとに少なくとも 10 個の胚に基づいています。 g については、補足表 9 に詳細な数値を報告します。 スケールバーは50μmです。 概略図は縮尺通りではありません。 ar アルケテロン、bl ブラストポア。

他の6つの追加のERK1 / 2依存性遺伝子は、5.5 hpfで4dを囲むミクロメアをパターン化し、中胚葉ドメインと後外胚葉ドメインを定義します（図5b、c）。 脊椎動物の胚の原腸形成中に中胚葉の発達を調節する転写因子foxH（補足図6e）40、41、42、43は、4dに隣接する4つのマイクロメアで検出されます（図5b、c）。環形動物ウレキス・カウポの系統追跡研究まで。 原腸形成中に、これらのfoxH + 細胞は直交する切断面で非対称な細胞分裂を起こし、最終的にMR細胞とML細胞を取り囲みます（図6d、e）。 その後、軸伸長中に、foxH発現は推定中胚葉前駆体の後部V字型パターンを形成し、幼虫段階で消えます（補足図6b）。 環形動物 Platynereis dumerilii44 の発生中に後部領域と D 象限で発現されるリガンド wnt1 および wntA (補足図 6f) は、ミクロメアの 2 つの左右対称の列で発現され、wntA は追加の 2 つの D 象限ミクロメアでも検出されます。 (図5b、c)。 脊椎動物の雄と雌の始原生殖細胞で発現するホメオボックスrhox（補足図6g）45は、D象限の2つの植物ミクロメアで検出され（図5b、c）、その後胚盤胞内の2つの小さな細胞で検出されます。原腸胚内（補足図5e）。 転写因子fer3とAP2は、それぞれ2つの単一のミクロメアとより広い後部外胚葉ドメインで発現され、幼虫の後胸膜嚢またはその近くの小さな発現ドメインに限定されます（図5b、c;補足図5c）。および6b）。 特に、5.5および6 hpfで分裂しないため、他の4qミクロメアよりも大きな細胞サイズを有する4d細胞（補足図1）は、ほとんどの細胞を含む周囲の細胞との二重の直接的な細胞間接触を確立します。 4a〜cの各娘細胞よりも、foxH、wnt1、wntA、rhox、およびAP2を発現する細胞の割合が高かった（図6e）。 したがって、これらの結果は、中胚葉および後背背の運命を定義する際の4dの誘導的役割の可能性を支持しますが、この仮説を実験的に検証するには細胞切除および/または細胞移植の研究が必要です。

ホメオボックス遺伝子 gsc は、5.5 hpf で D 象限の外側で発現する唯一の候補であり、予想される前外側胚盤門縁を占める A、B、および C 象限のミクロメアの U 字型ドメインで検出されます（図 5b、c）。 。 gsc の発現は ERK1/2 活性とは独立しており、D 象限外の位置と一致していますが、BFA 処理後に下方制御されます (補足データ 1)。 したがって、BFA処理体腔芽細胞ではgsc発現が消失しますが、U0126によるERK1 / 2活性の阻害によりgscドメインが拡大し、すべての胚象限で放射状に検出されるようになります（図6f;補足表9）。 実際、ERK1 / 2阻害された胚では、4qが4d細胞にならないため、すべての4qミクロメアが4q1と4q2に切断されます（図6f）。 したがって、すべての象限は前腹側運命（gsc）を採用し、AP2などの後部マーカー遺伝子の発現を防ぎます（図6f;補足表9）。 これらの結果は、U0126 後に観察された放射状表現型は 4d 細胞の誤った指定の結果であり、D 象限が指定されたもののそれ以上発達しなかった結果ではないことを示しています。 さらに、このデータは、gsc 発現の制限によって示されるように、ERK1/2 活性による 4d 細胞の特定が前方運命を抑制することも示しています。

ERK1/2活性化後の4dにおけるNotchリガンドデルタの上方制御は、後背部発達の促進における4dの役割がNotchシグナル伝達経路を介した直接的な細胞間コミュニケーションによって起こる可能性を示唆している。 この仮説を検証するために、4dの指定の前後に胚を小分子LY411575で処理しました。これは、Delta46によるNotch活性化の際に活性Notch細胞内ドメインを切断するガンマセクレターゼの選択的阻害剤です（図7a、b）。 。 受精から5hpfまでLY411575で処理した胚から成長した幼虫は、明らかな左右対称性と正常な器官形成を備えた正常な表現型を示します（図7b-e;補足表10）。 しかし、ERK1/2 活性が 4d 細胞を特定する 5 hpf 以降の Notch 経路の阻害は、左右対称、完全に前方に伸びた口、頂端器官を持つが後背部組織が短い貫通腸を備えた幼虫をもたらします。 「スタビー」と呼びます（図7b、c、f;補足表10）。 したがって、これらの幼虫は前口腔外胚葉でgscを発現し、cdxを発現する短い後腸を持っています（図7g;補足表11）。 したがって、「ずんぐりした」表現型は、前者では軸方向のアイデンティティが指定されているが、後者では前腹側運命のみが指定されているという点で、ERK1 / 2を阻害したときに観察される放射状表現型とは異なります（補足表3）。 特に、原腸胚の後背側外胚葉はノッチ状リガンドを発現し、デルタで観察されたように、その発現はERK1 / 2活性によって制御されます（図4d、補足図5f）。 まとめると、我々の発見は、4d細胞におけるERK1/2の活性化が、後部および背部構造の正常な発達に完全に必要である、この後背部細胞および周囲の後背部細胞におけるNotchシグナル伝達を促進することを裏付ける。 しかし、さらなる研究により、ERK1/2とNotchシグナル伝達を結び付けてO. fusiformisの軸発生を制御する正確な遺伝子制御ネットワークが解明されるだろう。

デルタリガンドが4d細胞で発現され（図5bを参照）、Notch受容体がその隣接細胞で発現される（図4d）、Notch-Deltaシグナル伝達経路の概略図。 b この研究で実施された 2 つの薬物治療ウィンドウの概略図 (時間間隔を指定する各バーの右側に症例数が表示されます)。 4dにおけるデルタアップレギュレーション後のNotchシグナル伝達経路の役割を評価するために、その特異化の前後に胚を処理しました。 c 各ウィンドウおよび実験条件（WT、野生型）で観察された幼虫の表現型の分布と割合。 d DAPI (核) およびアセチル化チューブリン (AcTub; 繊毛) で染色したコントロールおよび LY411575 処理胚 (0 ～ 5 hpf) の Z スタック投影。 対照胚と処理胚は正常な形態を示します。 e dと同様の治療条件における、頂端神経細胞型（syt1;シナプトタグミン-1）、口腔外胚葉（gsc）および4d由来組織および後腸（cdx）のマーカーのホールマウントin situハイブリダイゼーションの側面図。 対照および処理された胚からの幼虫は、正常な遺伝子発現パターンを示します。 挿入図は腹側の図であり、矢印は発現ドメインを示しています。 DAPI (核) およびアセチル化チューブリン (AcTub; 繊毛) で染色した、コントロールおよび LY411575 処理胚 (5 ～ 25 hpf) の f z スタック投影。 処理された胚からの幼虫は、左右対称性と正常な頂端器官を示しますが、後背側が減少し、後腸が短く/異常で、胸管領域が未発達です。 私たちはこの表現型を「ずんぐりした」と名付けました。 e fと同様の治療条件における、頂端神経細胞型（syt1;シナプトタグミン-1）、口腔外胚葉（gsc）および4d由来組織および後腸（cdx）のマーカーのホールマウントin situハイブリダイゼーションの側面図。 挿入図は腹側の図であり、矢印は発現ドメインを示しています。 d–g では、アスタリスクは前極/頂極を示します。 b の説明は、少なくとも 2 つの生物学的複製からの、ステージごとに少なくとも 10 個の胚に基づいています。 b ～ g については、補足表 11 に詳細な数値が報告されています。 スケールバーは50μmです。 ch チャエテ、hg 後腸、mg 中腸、mo 口、pt プロトトロク。

脊椎動物の胚では、ERK1/2 活性を介した FGF シグナル伝達が、後体幹伸長中の発生中の後腸および前体節中胚葉における cdx とデルタの発現を制御します 47。 したがって、我々は、FGFシグナル伝達が、O. fusiformisの4日間のERK1 / 2活性を駆動する上流制御因子である可能性があると仮説を立てました（図8a）。これは、cdxおよびデルタの発現を誘導し、後腸および幹の中胚葉前駆細胞を特定するためにも必要です。 Owenia fusiformis は、ヒト FGFR1 オルソログと比較して、重要な機能残基でアミノ酸の保存性が高い単一の FGF 受容体 (FGFR; 補足図 7a) を持っています (補足図 7b)。 FGFRは原腸胚段階で転写的に上方制御され、主に原腸胚以降の中胚葉派生物で発現しているようですが（補足図7c、d）、FGFRはO. fusiformisの体腔芽細胞期の腹板で弱く発現しているようです（図8b） ）、腕足類やフォロニッド類でも観察されています48。 この段階では、FGF リガンドは弱く発現されるだけであり (補足図 7c)、in situ ハイブリダイゼーションでは検出されません。 FGFRリン酸化と活性化の選択的阻害剤である30μM SU5402で処理すると49（図8a）、5hpfで処理した胚の96％で4d細胞でのdi-P-ERK1 / 2濃縮が妨げられます（図8c;補足図。 7e)。 実際、4dミクロメアの指定中にSU5402で処理すると（4〜6 hpfおよび3〜7 hpf、図6c、補足表12）、表現型は前方放射状になり、胚は後腸（後腸およびcdx発現）を欠く幼虫に発育します。 ）および中胚葉（筋肉およびねじれの発現）構造が減少し、放射状に拡張された口腔外胚葉運命（gsc）を示しています（図8g;補足表3）。 したがって、形態学的および遺伝子マーカーの観点からは、この放射状表現型は、U0126 および BFA で ERK1/2 の二リン酸化を阻害した後に得られる表現型に似ています。 逆に、4日間のジ-P-ERK1 / 2濃縮前の処理（3〜5 hpf）は、わずかに圧縮された表現型を引き起こします（補足図6f）。これは、同等の時点でBFAで細胞内タンパク質輸送をブロックしたときに観察されたものと同様です。 したがって、FGFRの阻害はERK1 / 2活性化をブロックし、U0126およびBFAの効果を表現模倣し（図3c）、FGFシグナル伝達活性がO. fusiformisの4d特異化の上流にあり、4d特異化に必要であることを示唆しています。

a 下流の細胞内 FGFR 経路の概略図。 薬剤 SU5402 は、ERK1/2 シグナル伝達カスケードを通じてシグナル伝達できる FGF/VEGF 型の受容体チロシンキナーゼを特異的に阻害します。 b O. fusiformis の体腔芽細胞期における FGFR および VEGFR のホールマウント in situ ハイブリダイゼーション。 FGFR は、4d で指示された後方リパターニング時に腹板で弱く発現されます。 しかし、SU5402 治療でも阻害できる VEGFR は、この段階では発現していません。 c ジリン酸化 ERK1/2 (di-P-ERK1/2) に対するホールマウント免疫組織化学。 SU5402 処理胚は、受精後 5 時間 (hpf) で植物ミクロメア内の ERK1/2 濃縮を失います。 メイン画像は側面図、挿入図は植物図です。 d 4d仕様（5hpf）の期間を対象として、この研究で実施された薬物治療ウィンドウの概略図。 ケースの数は、時間間隔を指定する各バーの右側に表示されます。 e 各ウィンドウおよび実験条件（WT、野生型）で観察された幼虫の表現型の分布とパーセンテージ。 f 幼虫段階で固定され、DAPI（核）、ファロイジン（F-アクチン）およびアセチル化チューブリン（繊毛）で染色された、対照および4〜6 hpf SU5402処理胚のzスタック投影の側面図。 処理された幼虫は、U0126 放射状幼虫の表現型の表現型を示します。 左側は、コントロールと放射状幼虫の表現型の側面図の概略図です。 g 幼虫段階で固定されたコントロールおよび 4 ～ 6 hpf SU5402 処理胚の 5 つの細胞型マーカーのホールマウント in situ ハイブリダイゼーションの側面図。 処理された胚は、拡大した口腔外胚葉マーカー (gsc)、減少した頂端外胚葉マーカー (six3/6)、後腸と体幹中胚葉遺伝子 (それぞれ cdx とツイスト) の欠如、および正常な中腸マーカー (GATA4/5/6b) を持つ放射状幼虫に発育します。 。 挿入図は腹側から見た図です。 b、c、f、g では、アスタリスクは頂端極を指します。 d ～ g については、補足表 12 に詳細な数値が報告されています。 スケールバーは50μmです。 概略図は縮尺通りではありません。 肛門、 ao 頂端器官、ch chaetae、gp 腹部プレート、mg 中腸、mo 口、pt プロトトロク。

FGFR、ERK1/2、Notchシグナル伝達経路の機能的特徴付けと、条件付き発生様式を持つ環形動物であるO. fusiformisの比較トランスクリプトミクスを組み合わせた我々の研究は、らせん状卵割の際の初期の体のパターン形成を制御する祖先の遺伝原理に関する長年の疑問8を解決した。 自律環形動物で観察されるものとは異なり25、26、27、28、我々の研究は、FGFRおよびERK1/2シグナル伝達が、推定上の胚形成体である4dミクロメアを特定し、中胚葉および後背葉に関与する下流遺伝子を活性化することによって軸方向のパターン形成を誘導するという説得力のある証拠を提供する。 O. fusiformis での発生 (図 9a)。 一部の軟体動物で観察されているように10、20、FGFR / ERK1 / 2活性は、4d細胞の細胞周期の進行を遅らせることによって胚の四放射対称性を破ります（図2e、図6f、補足図1c、d）。したがって、細胞分裂を促進するのではなく、細胞分裂を阻止することが、らせん状胚における軸方向のパターニングに関連した ERK1/2 シグナル伝達の一般的な役割であると考えられます 18。 4dおよび後背背側のアイデンティティの指定に伴い、前方運命はA〜C象限に制限されるようになり（図6f）、これは、未知の反対のシグナル（1つは前方運命を指定し、もう1つはFGFR / ERK1 / 2を介して4d仕様を駆動する）が存在する可能性があることを示唆していますは同時に作用して、O. fusiformis の軸極性を定義します（図 9a）。 これらのシグナルを同定するにはさらなる研究が必要であるが、我々は、前方化の手がかりは、それらの段階ですでに特定されている細胞系統（中腸や頂端器官など）、または細胞自律性の母性決定因子から選択的に除去されるものに由来するに違いないと仮説を立てている。 4d 仕様の D 象限。 さらに、FGFR / ERK1 / 2活性は、4d細胞のNotchリガンドデルタと原腸の後背側外胚葉のノッチ様受容体を上方制御し（図4d、図5b）、したがってNotch-Deltaシグナル伝達を上方制御します。細胞間の直接的な阻害/誘導によって細胞運命を微調整するために広く使用されている経路50-は、O. fusiformisの後背背および中胚葉の発生に必要な下流エフェクターの1つです（図7f、g、図9a）。 まとめると、我々の発見は、条件付き螺旋切断を伴う環形動物の初期発生の包括的なモデルを示しており、この動物クレードとスピラリア属全般の体のパターン形成を支える正確な制御論理を詳細に分析するさらなる研究の基礎となる。

O. fusiformis の後期らせん切断中の 4d ミクロメアにおける FGFR/ERK1/2 活性の概略モデル。 受精後 4 時間 (hpf) では、二リン酸化された ERK1/2 (di-P-ERK1/2) が頂端の最もミクロメア (1q111) に濃縮されます。 5 hpf では、未確認のシグナルが FGF 受容体を活性化し、4d ミクロメア内の ERK1/2 を二リン酸化します。 これは、4d の cdx とデルタを活性化します (内内胚葉前駆体になります)。これは、4a – 4c 切断として 4d が細胞周期の進行を停止することとも相関します。 4dにおけるERK1/2の活性化は、前方遺伝子（例、gsc）をA-C象限に制限するために必要であるが、この相互作用の正確な性質は不明である（点線）。 さらに、4d における ERK1/2 活性は、D 象限と C 象限の一部で一連の遺伝子の発現を誘導し、おそらく側方中胚葉および後背背運命を誘導し、最終的に軸方向の伸長を制御します。 この段階から、ノッチデルタ経路は正常な後背背発達に必要であり、4d 細胞の誘導活性を隣接する細胞に伝達することに寄与している可能性があります (点線)。 b 異なる左右相称系統における前後軸伸長時の胚の概略図。各系統におけるFGFR、ERK1 / 2、およびこの研究で同定されたいくつかの候補遺伝子間の相互作用が左側に示されています。 O. fusiformis および他の軟体動物胚における D 象限の胚オーガナイザーの指定における ERK1/2 活性化の同様の関与は、ERK1/2 陽性の胚オーガナイザーの存在がらせん卵割に対する共通の祖先形質であることを示唆しています。 より広範には、ERK1/2 活性は、左右対称の胚における軸方向のパターン形成と後部幹の成長に繰り返し関与する一連の遺伝子とシグナル伝達経路の発現を誘導します。 軸方向の組織化と後部伸長中心の形成は、ほとんどの左右相称系統では空間的および時間的に切り離されていることが多いが、らせん状動物ではそれらは胚組織化活動（すなわち、D象限胚組織化機構の仕様）の単一の発生プロセスに統合されるようになる。 。 図面は縮尺通りではありません。 A 前部、P 後部、D 背部、V 腹部。

O. fusiformis の 4d 割球における FGFR/ERK1/2 の活性化による軸同一性と体のパターン形成の制御は、条件付き環形動物 H. hexagonus の 4d 細胞における ERK1/2 の活性と一致しています。 また、これは軟体動物で観察される条件を反映しており、初期ERK1 / 2活性のパターンは多少多様である10,21（補足表1）にもかかわらず、一般に活性型ジリン酸化ERK1 / 2を使用して、3D割球のいずれかの後背側胚オーガナイザーを特定および制御します。またはその娘の 4d セル。 実際、O. fusiformis の後腸への 4d の寄与は軟体動物でも観察されます 51,52 が、一部の自律環形動物では観察されません 53。また、Notch シグナル伝達は軟体動物 Tritia obsoleta における 4d 細胞の潜在的な指示的役割を裏付ける可能性もあります 54 (図 9a) ）。 しかし、D 象限と胚形成機構の仕様は、動物のミクロメアと軟体動物の将来の 3D 細胞との間の直接的な細胞間接触と、現時点では未知の誘導シグナルに依存しています 55。これは、O. fusiformis 30 や他の条件付き環形動物 29 では起こりそうにありません。 4q ミクロメアの形成時の大きな胚盤胞。 その結果、3D/4d 細胞における ERK1/2 活性の上流調節因子は、軟体動物と環形動物の間で異なる可能性があり、したがって、これら 2 つのグループ間で観察される細胞内経路と軸方向指定時の読み取り値の類似性は、次の結果である可能性があります。収斂進化。 しかし、別の、より倹約的なシナリオは、胚オーガナイザーとして機能する細胞におけるERK1 / 2の活性化および軸方向パターン形成の役割が環形動物および軟体動物と相同であり（図9b）、したがってらせん状卵割の基本的形質であるというものである。 したがって、自律環形動物で観察された一連の ERK1/2 パターン 26、27、28 (補足表 1) は、おそらく細胞運命指定の自律モードへの移行に関連した祖先 ERK1/2+ オーガナイザーの独立した喪失を表していると考えられます。 将来的には、環形動物や軟体動物のERK1/2活性を制御する上流の遺伝子制御ネットワークをより深く理解することで、このシナリオを検証し、Spiralia全体の胚形成体の細胞同一性の多様性を促進するメカニズムを分析するのに役立つでしょう。

より一般的には、私たちの研究は、条件付きらせん動物の胚オーガナイザーと後背側のアイデンティティを指定する分子カスケードと、新口動物とエクジソゾアの軸方向のパターン形成と後方成長を調節する遺伝子モジュールとの間の顕著な類似性を明らかにしています47、48、56、57、58（図9b;補足）表13）。 正確な制御ロジックは主要系統間で異なり、場合によっては系統発生的に関連する分岐群間でも異なりますが、ERK1/2 活性は棘皮動物、半索動物、脊索動物の背腹パターン形成の中心であり、FGFR とともに脊索動物の後方成長に寄与し、脊索動物の発現を促進します。成長する尾の後端のcdxとデルタ（図9b;補足表14およびその中の参考文献）。 同様に、FGFR シグナル伝達は、節足動物であるクモの背腹パターン形成を駆動します (補足表 14)。 Notch-Deltaシグナル伝達経路は、半索動物、脊索動物、節足動物の後部伸長にも関与し、線虫の後部および背腹部の同一性を制御します（図9b;補足表14およびその中の参考文献）。 したがって、古くから広く保存されている遺伝原理と発生原理が、らせん卵割における細胞運命指定の条件付きモードを支えており、この発生モードがSpiraliaの祖先の条件を表すという見解をさらに強化しています11、12、13。 しかし、他の初期胚形成とは異なり、らせん状の卵割は、非常に独特な定型的な細胞分裂パターンと割球数の少ない初期発生を伴い、単一の組織化細胞内で軸方向の同一性と後方発生の指示を時間的および空間的に組み合わせます。軟体動物の 3D/4d、そして環形動物の 4d 細胞の可能性が最も高い (図 9b)。 この細胞と、その保存された指示パターン形成の役割が、その後のらせん状虫の大きく異なる成体の形態の発達をどのように促進するのかは未解決の疑問であり、らせん状系統にわたるD象限オーガナイザーの下流の遺伝モジュールの詳細な研究が解決に役立つであろう。

O. fusiformis Delle Chiaje, 1844 の成体標本は、繁殖期 (5 ～ 7 月) にステーション ビオロジック ド ロスコフ (フランス) 近くの海岸から収集されました。 研究室では、動物を 15 °C の人工海水 (ASW) に入れました。 体外受精は前述のように実施され 3,30、胚は濾過した ASW を入れたガラスボウル内で 19 °C で所望の胚期まで発育します。

胚は、ブレフェルジン A (BFA; Sigma-Aldrich、#B7651)、U0126 (Sigma-Aldrich、#U120)、LY411575 (Sigma-Aldrich、#SML0506)、または SU5402 (Sigma-Aldrich、#572630) のいずれかで処理されました。 すべての薬剤ストックはジメチルスルホキシド (DMSO) で作成され、使用前に ASW で希釈され、最初の滴定後に最適な使用濃度 (BFA および U0126 については 10 μM、LY411575 については 100 μM、SU5402 については 30 μM) が設定されました。 すべての薬物治療について、陰性対照として等量のDMSOを使用し、すべての場合において、治療は受精後約0.5時間（hpf）、受精および精子除去の直後、または各図に示されているとおりに開始しました。 ASW で少なくとも 3 回の洗浄で薬物を洗い流すことによって治療を停止し、下流の分析のために胚を収集するか、幼虫期まで飼育しました。 免疫組織化学および遺伝子発現分析のために収集したサンプルを、ASW 中の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で室温 (RT) で 1 時間固定しました。 幼虫を固定前に 8% 塩化マグネシウム (MgCl2) で弛緩させ、8% MgCl2 中の 4% PFA で室温で 1 時間固定しました。 固定後、サンプルを 0.1% Tween-20 リン酸緩衝生理食塩水 (PTw) で数回洗浄し、免疫組織化学のために 4 °C で PTw に保存するか、ホールマウント用に 100% メタノールに脱水して -20 °C で保存しました。現場ハイブリダイゼーション。 RNA-seq 解析のために収集した処理済みおよび対照の胚および幼虫は、液体窒素中で瞬間凍結し、全 RNA 抽出前に -80 °C で保存しました。

F-アクチン標識および抗体染色は、前述のとおりに実施しました 30 が、抗ジ P-ERK1/2 染色のために収集したサンプルを、1:100 希釈のホスファターゼ阻害剤を添加した PTw で洗浄するという修正を加えました (Cell Signalling、#5872)。 ）固定後。 一次抗体はマウス抗二重リン酸化 ERK1/2 (Sigma-Aldrich、#M8159、1:200) およびマウス抗アセチル化 α-チューブリン (クローン 6-11B-1、Millipore-446 Sigma、#MABT868、1:500) ）を、0.1％ Triton X-100リン酸緩衝生理食塩水（PTx）中の5％正常ヤギ血清（NGS）で希釈し、4℃で一晩（ON）インキュベートしました。 PTx 中の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で数回洗浄した後、サンプルを抗マウス ペルオキシダーゼ (POD) 結合抗体 (Millipore-Sigma、#11207733910、1:100) または AlexaFluor594 結合抗体 ( ThermoFisher Scientific、#A32731、1:600）を 4 °C の PTx ON 中の 5% NGS で希釈しました。 マウス抗二重リン酸化 ERK1/2 および抗マウス POD 結合抗体とインキュベートしたサンプルの場合、ジアミノベンジジン (DAB) (Vector Laboratories、#SK-4100) またはチラミド シグナル増幅キット (Akoya Biosciences、#NEL742001KT) を使用してシグナルを発生させました。 ) メーカーの推奨に従ってください。 DAB で作成したサンプルを 70% グリセロールで保存し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI、ThermoFisher Scientific、#D3571、1:1000) 核マーカーで対比染色しました。 レーザー走査型共焦点顕微鏡 (LSCM) 用のサンプルを、PTx 中の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で希釈した DAPI で RT で 1 時間対比染色し、70% グリセロールにマウントしました。

Monarch total RNA Miniprep Kit (New England Biolabs、#T2010) を使用して全 RNA を抽出し、Illumina の鎖 mRNA ライブラリーの調製に使用しました。 シーケンスは Illumina HiSeq 4000 プラットフォームで 75 塩基のペアエンド出力モードで実行され、サンプルあたり約 2,000 万のリードが生成されました。 アダプター配列と低品質塩基は、Trimmomatic v.0.3659 を​​使用して除去されました。 次に、Kallisto v.0.44.0 を使用して、クリーニングされたリードを O. fusiformis 参照ゲノム アノテーション 33 (ヨーロッパ ヌクレオチド アーカイブ リポジトリでアクセッション番号 GCA_903813345 で入手可能) にマッピングし、遺伝子発現数 60 を生成しました。 差次的遺伝子発現解析は各薬物に対して独立して実行され、R パッケージ DEseq2 v.1.38.061 を使用して、さまざまな段階と条件をペアごとに比較して計算されました。 有意性の閾値は、p 値 ≤ 0.05 および Log2 倍率変化 > 1.5 または < -1.5 に調整されました (補足データ 1)。 PCA と階層的クラスタリングは、それぞれ ggplot2 と pheatmap R パッケージを使用してプロットされました。 ボルケーノプロットは、R で利用可能なパッケージ EnhancedVolcano を使用して取得しました。さらなる遺伝子発現解析の候補遺伝子は、両方の薬物処理 (U0126 および BFA) で差次的に発現するか、または U0126 処理胚において 5.5 hpf で高度に差次的に発現するかに基づいて選択されました。 遺伝子オントロジー（GO）カテゴリー（補足データ2）に基づいて選択をさらに洗練し、転写因子と発生遺伝子（補足表6）に焦点を当てました。

GO マッピングでは、各比較に関連する差次的に発現された遺伝子の GO タームが O. fusiformis 参照ゲノム注釈 33 (リポジトリ https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome で入手可能) から抽出されました。 GO エンリッチメント分析は GOseq R パッケージを使用して実行され、遺伝子長のバイアス 62 を補正し、上方制御された遺伝子と下方制御された遺伝子を個別に分析しました。 補正された p 値 < 0.05 の GO 項は、有意に濃縮されているとみなされます (補足データ 2)。 京都遺伝子ゲノム百科事典 (KEGG) 経路濃縮分析でも同様のアプローチに従い、示差的に表された KO 数をそれぞれの KEGG 経路にマッピングしました (補足データ 1)。

一般に、遺伝子オーソロジーは、SwissProt データベースに対する BLAST 検索および Panther 検索に基づく、O. fusiformis 遺伝子レパートリーの機能アノテーションに基づいていました (機能アノテーションはリポジトリ https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome で入手可能)。 ERK1/2 および ERK5、WNT リガンド、RHOX および関連ホメオボックス、DLL および JAGGED、FOXH および FOXF 遺伝子、FGFR および VEGFR のタンパク質配列は、公的に入手可能なトランスクリプトームおよびデータベースをマイニングすることによって検索されました。 複数のタンパク質アラインメント (補足データ 1 で利用可能) は自動モード 63 の MAFFT v.7 で構築され、アラインメントが不十分な領域は gBlocks バージョン 0.91b64 で削除されました。 最尤ツリーは RAxML v.8.2.1165 または FastTree66 のいずれかで構築され、FigTree (https://github.com/rambaut/figtree/) で視覚化されました。 InterProScan 567 を使用して、DLL のタンパク質ドメイン構成を実行しました。

薬物表現型を特徴付けるために使用される候補遺伝子 (補足表 6) と遺伝子マーカーは、混合発生段階の cDNA を初期テンプレートとして遺伝子特異的プライマーと T7 ユニバーサル プライマーを使用した 2 ラウンドのネステッド PCR によって増幅されました。 リボプローブは、T7 酵素 (Ambion の MEGAscript キット、#AM1334) を使用して合成し、ハイブリダイゼーションバッファー中に 50 ng/μl の濃度で -20 °C で保存しました。 比色および蛍光ホールマウント in situ ハイブリダイゼーションは、確立されたプロトコールに従って実行されました 3,30。 プローブの洗浄後、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション用のサンプルを抗 DIG-POD Fab フラグメント (ROCHE、#11633716001) およびマウス抗アセチル化 α-チューブリン抗体 (クローン 6-11B-1、Millipore-446 Sigma、#) とともにインキュベートしました。 MABT868、1:500) を使用して細胞境界を共染色します。 チラミドシグナル増幅キット（Akoya Biosciences、#NEL742001KT）でシグナルを発生させた後、これらのサンプルを PTx で数回洗浄し、上記のように二次抗体インキュベーションのために処理しました。 開発中のインシリコ遺伝子発現ダイナミクスを特徴付けるために、R で利用可能なパッケージ pheatmap v.1.0.12 を使用した 2 つの複製の平均発現を表す、利用可能な段階固有の RNA-seq データセット 33 を使用しました。色の強度は z-各遺伝子のスコア値。

6 つの形態学的マーカーと 6 つの分子マーカーの組み合わせを使用して、すべての薬物治療後に得られた表現型を特徴付けました (補足表 3)。 簡単に説明すると、共焦点スキャン画像の視覚的検査と Z スタック投影を使用して、毛虫、前腸および後腸、筋肉 (前腸、鎖芽細胞および挙筋)、頂端器官 (頂端繊毛房を含む)、および頂端器官ニューロンの存在を評価しました。 。 これらの幼虫構造の有無を裏付けるために、比色ホールマウント in situ ハイブリダイゼーションを通じて細胞型特異的分子マーカー、すなわち six3/6 (頂端外胚葉および食道)、gsc (前口腔外胚葉)、cdx の発現を評価しました。 (後腸)、GATA4/5/6 (中腸)、ツイスト (中胚葉)、およびシナプトタグミン-1 (ニューロン)。 我々は、圧縮された表現型を、野生型と同様の形態と分子パターンを持つが、頂腹軸が平坦である幼虫として定義します。 放射状表現型は後腸および中胚葉の構造およびマーカーを欠き、口腔外胚葉マーカー gsc の放射状発現を示し、頂端器官ニューロンおよび頂端器官の数が減少しています。 「ずんぐりした」表現型は、対照幼虫の左右対称性とすべての形態学的ランドマークを示しますが、後部領域と中胚葉は未発達です。 補足図3dは、対照表現型、圧縮表現型、および放射状表現型と、それぞれの形態学的/分子ランドマークの概略図を示しています。

比色分析からの代表的な胚および幼虫は、Infinity5 カメラ (Lumenera) を備えた Leica DMRA2 正立落射蛍光顕微鏡で、明視野および微分干渉コントラスト光学系を使用して画像化されました。 蛍光染色したサンプルを Leica SP5 LSCM でスキャンしました。 共焦点スタックはフィジーで分析され、明るさ/コントラストおよびカラーバランスは Pixelmator Pro (v. 2.0.3) または Photoshop (Adobe) で調整され、変更は画像の一部ではなく常に画像全体に適用されました。 最終的な図は Illustrator (Adobe) を使用してデザインされました。

cdx 遺伝子座およびデルタ遺伝子座の周囲のクロマチンにアクセス可能な領域の転写因子モチーフを同定するために、5 hpf で 850 ～ 900 個の体腔芽細胞からの 50,000 個を超える細胞から生成された、シーケンス (ATAC-seq) ライブラリを使用したトランスポザーゼ アクセス可能なクロマチンの既に利用可能な 2 つの複製アッセイ (ATAC-seq) ライブラリ 33 を使用します。 簡単に説明すると、細胞を氷冷した ATAC 溶解バッファー (10 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.1% (v/v) IGEPAL、0.1% (v/v) Tween-20、 ０．０１％（ｖ／ｖ）ジギトニン）を乳棒を穏やかに使用して加え、氷上で３分間インキュベートした。 氷冷した PBS で素早く洗浄し、氷冷した ATAC 溶解バッファーにさらに再懸濁した後、氷冷した ATAC 洗浄バッファー (10 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.1% (v)) で溶解反応を停止しました。 /v) Tween-20) を加え、チューブを静かに 3 回反転させて混合します。 次に、固定角遠心分離機で 4 °C、500 g で 10 分間遠心分離して核をペレット化し、Omni-ATAC プロトコールに従ってクロマチンタグメンテーションとライブラリーの調製を実行しました68。 リードマッピングとピークコーリングは他の場所で説明されているように実行され 33、転写因子モチーフの濃縮とクロマチンアクセス領域でのフットプリンティングは、複製間の再現可能なピークのトラックを使用して、それぞれ HOMER v.4.1169 と TOBIAS v.0.12.070 で実行されました (p < 0.05) ）Gene Expression Omnibus でアクセッション番号 GSE184126 およびパブリック リポジトリ (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome) から入手できます。 ゲノム トラックは pyGenomeTracks v.2.171 を使用してプロットされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるデータが論文とその補足情報ファイル内で入手可能であることを宣言します。 この研究で生成されたすべての生の RNA-seq 配列データは、欧州ヌクレオチド アーカイブ (ENA) でアクセッション番号 PRJEB47195 として入手できます。 さらに、この研究では、ENA でアクセッション GCA_903813345 で入手可能な Owenia fusiformis のゲノム アセンブリとアノテーション、および Gene Expression Omnibus でアクセッション番号 GSE184126 およびパブリック リポジトリ (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome) で入手可能な ATAC-seq ピークを使用しました。 ）。

この調査ではカスタム コードは使用されませんでした。

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Ferdinand Marlétaz 氏、Daria Gavriouchkina 氏、Bruno Vellutini 氏、および原稿に対するサポートと貴重なコメントをいただいた Martín-Durán 研究室のメンバー全員、RNA-seq 解析にご協力いただいた Sandra Álvarez-Carretero 氏、Station Biologique de Roscoff のスタッフに感謝します。コレクションと動物供給に関する支援、および RNA-seq シーケンス データの生成と初期処理については、ウェルカム センター フォー ヒューマン ジェネティクス (ウェルカム トラスト助成金参照 203141/Z/16/Z によって資金提供) のオックスフォード ゲノミクス センターに支援していただきました。 この研究は、JMM-D への欧州研究評議会開始助成金 (アクション番号 801669) によって資金提供されました。 クイーン・メアリー、ロンドン大学 OS の学生

これらの著者は同様に貢献しました: Océane Seudre、Allan M. Carrillo-Baltodano。

生物行動科学部。 クイーンメアリー大学ロンドン校、Mile End Road、E1 4NS、ロンドン、英国

オセアン・スードレ、アラン・M・カリーロ＝バルトダノ、ヤン・リャン、ホセ・M・マルティン＝デュラン

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OS、AMC-B。 そしてJMM-D。 研究を考案し、設計しました。 OS、AMC-B、YL、JMM-D。 すべての実験的アプローチを実行し、データを批判的に分析しました。 OS、AMC-B。 そしてJMM-D。 原稿を書きました。 著者全員が原稿を読んでコメントしました。

ホセ・M・マルティン・デュランへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Paschalis Kratsios と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Seudre、O.、Carrillo-Baltodano、AM、Liang、Y. 他 ERK1/2 はらせん切断における祖先の組織化シグナルです。 Nat Commun 13、2286 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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受信日: 2021 年 8 月 8 日

受理日: 2022 年 4 月 11 日

公開日: 2022 年 4 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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