イチョウ葉エキスは脈絡膜循環を改善し、マウスの近視を抑制します

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3772 (2023) この記事を引用

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近視は世界中でますます一般的になりつつあり、予防法の開発が必要となっています。 私たちは、初期成長応答 1 (EGR-1) タンパク質の活性を調査し、イチョウ葉抽出物 (GBE) が in vitro で EGR-1 を活性化することを発見しました。 インビボでは、C57BL/6 J マウスに通常食または 0.0667% GBEs (200 mg/kg) 混合飼料を与え (各 n = 6)、生後 3 週目から 6 週目まで -30 ジオプター (D) レンズを使用して近視を誘発しました。 。 屈折率と眼軸長は、それぞれ赤外フォトリフレクターとSD-OCTシステムによって測定されました。 水晶体誘発性近視マウスでは、経口GBEにより屈折異常（-9.92±1.53D対-1.67±3.51D、p<0.001）および軸伸長（0.22±0.02mm対0.19±0.02mm、p<0.05）が有意に改善された。 。 近視の進行を防ぐGBEのメカニズムを確認するために、生後3週目のマウスを、近視誘発または非近視誘発のいずれかを通常に与えたグループと、近視誘発または非近視誘発のいずれかを与えたGBEに分けました。 (n = それぞれ 10)。 脈絡膜血液灌流は光干渉断層撮影血管造影法 (OCTA) で測定されました。 両方の非近視誘発群において、通常の食事と比較して、経口GBEは脈絡膜血液灌流(8.48±15.75%面積対21.74±10.54%面積、p<0.05)およびEgr-1および内皮一酸化窒素シンターゼの発現(p<0.05)を有意に改善した。 eNOS）は脈絡膜にあります。 両方の近視誘発群において、通常の食事と比較して、経口GBEは脈絡膜血液灌流も改善し(-9.82±9.47%面積対2.29±11.84%面積、p<0.05)、脈絡膜厚の変化と正の相関があった。 これらの発見は、GBE が脈絡膜血液灌流を改善することによって近視の進行を抑制する可能性があることを示唆しています。

近視は世界中の人々に影響を与える重大な目の病気であり、近視の発生率は年々増加しており、2050年までに世界人口の半数が近視になると予想されています1、2、3。 新型コロナウイルスの流行と一連のロックダウンや自宅隔離政策により、屋外活動の制限により近視の話題が再び注目されています4,5。 近視の進行をどのように解消または軽減するかは、無視できない深刻な問題です。

現在、近視の進行を制限するためのさまざまな戦略があります。 よく知られている薬理学的介入 (例、アトロピン、ピレンゼピン、7-メチルキサンチン) や光学的介入 (例、オルソケラトロジー、周辺焦点ぼかしレンズ) 6,7 に加えて、屋外でより多くの時間を過ごすことも、最も安全で最も安全な方法の 1 つとして浮上しています。近視の進行を軽減するための重要な戦略8、9、10。 屋外で過ごす時間を増やす最も重要な要素は、屋外の明るい光にさらされることです11。

屋外の光は、赤ではなく青や緑などの短波長の可視成分が大半を占めるスペクトル構成を持っています12。 さらに、ブルーライトは近視を抑制することが報告されています13。 私たちの以前の研究では、青色光よりも波長が短い屋外環境の紫色光が、ニワトリやマウスの近視モデルや人間の近視の発症を抑制することが実証されており、さらに、紫色光への曝露により近視抑制遺伝子が上方制御されることが証明されています。 Egr-1 は in vitro と vivo の両方で 14、15。 Egr-1 は、近視の軸伸長と進行を制御するタンパク質をコードする遺伝子です 16、17、18。 さらに、Egr-1 ノックアウトマウスは、より長い眼軸長と近視性の屈折シフトを示しました 19,20,21。 Egr-1の発現が近視抑制の評価遺伝子として利用できると考え、培養細胞株でルシフェラーゼアッセイを実施し、207種類の天然物および有機化学物質をスクリーニングしたところ、クロセチン含有クチナシ果実抽出物の純度が75%以上であることが判明しました。 AはEGR-122の最大限の活性化を実証しました。 クロセチンはマウスの実験的近視の発症を抑制することが実証されており、小児の近視進行を抑制する効果がある可能性があります 22,23。 イチョウ葉抽出物 (GBE) は、EGR-122 の 2 番目に強い活性化剤であることが判明しました。 したがって、GBE もクロセチンと同様に近視の進行を抑制する効果があると考えるのが合理的です。

イチョウは扇形の葉を持つ大きな木です。 中国、日本、韓国が原産ですが、現在ではヨーロッパや米国でも栽培されています。 伝統的な中国医学では、5,000 年以上にわたってイチョウの木の果実と種子が利用されており、喘息、咳、夜尿症の治療に推奨されています 24,25。 ドイツの製薬会社は 1964 年に EGb 761 と呼ばれるイチョウ葉エキスを作成し、それ以来、人間および動物モデルにおけるイチョウの効果について何百もの研究が行われてきました 26。 数十年にわたる粘り強い研究の後、GBE は、抗酸化 27、抗ウイルス 28、抗炎症 29,30、抗腫瘍 31,32、免疫調節 33、肝臓保護特性 34 など、幅広い生物学的作用を示すことが示されています。 注目すべきことに、GBE は血液循環に有益な影響を与えるため、緑内障やその他の虚血性眼疾患の潜在的な治療法としても浮上しています 35,36。 近視における軸方向の伸びが増加すると、網膜、脈絡膜、強膜の組織が薄くなり、眼の血流が妨げられます。 モルモットでは、実験的な近視誘導中に脈絡膜の厚さと脈絡膜血液灌流が減少し、その後回復中に増加することが判明しました 37,38,39。 その結果、我々は、GBEの経口投与がマウスモデルにおける実験的近視の進行を抑制できるかどうかをさらに評価し、GBEが脈絡膜血液灌流を増加させることによって近視を抑制するかどうかを決定することを目的とした研究を実施した。

EGR-1 の活性に対するさまざまな濃度の GBE の影響は、ヒト胎児腎臓アデノ随伴ウイルス EGR-1-Luc 細胞 (HEK 293AAV EGR-1-Luc 細胞) 株によって検出されました。この細胞株は、一連の実験によって得られました。 Cell Biolabs, Inc. から購入した HEK 293AAV 細胞株のトランスフェクションと継代を調べました。この研究では、EGR-1 活性に 0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、0.75 mg/ml の 3 つの濃度の GBE を使用しました。アッセイでは、化合物を含まないジメチルスルホキシド (DMSO) をネガティブコントロールとして使用し、ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) をポジティブコントロールとして使用しました (各グループ n = 6)。 実験グループとポジティブコントロールグループの値は、ネガティブコントロールグループと比較した倍数として示されています。 ネガティブコントロールグループと比較して、ポジティブコントロールグループは EGR-1 活性の統計的に有意な増加を示し、活性化は 3.57 ± 0.65 倍でした (p < 0.001)。 0.25 mg/ml の GBE の場合、EGR-1 活性化は 1.59 ± 0.13 倍 (p < 0.001)、0.50 mg/ml の GBE の場合、EGR-1 活性化は 1.77 ± 0.40 倍 (p < 0.01) でした。 0.75 mg/mlのGBEでは、EGR-1活性化は1.17 ± 0.60倍でした（p = 0.520）（図1）。

ルシフェラーゼアッセイにおける EGR-1 活性化に対するさまざまな GBE 濃度の影響。 GBE を 3 つの異なる用量でテストしたところ、0.25 mg/ml および 0.5 mg/ml の濃度の GBE の両方で、ルシフェラーゼ アッセイにおいて EGR-1 活性の統計的に有意な増加が示されました (n = 6)。 **p < 0.01、***p < 0.001。 棒は平均 + / - 標準偏差を表します。 統計分析には一元配置分散分析を使用しました。 EGR-1: 初期成長応答タンパク質 1。 GBE: イチョウ葉エキス。 DMSO: ジメチルスルホキシド; PMA: ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート。

近視の進行に対するGBEの経口投与の効果を、水晶体誘発性近視（LIM）のマウスモデルで調べた。 このモデルは、以前に確立されたモデルとほぼ同じです 40 が、単眼での近視の誘発が両眼での同時の近視の誘発に変更されており、これは私たちの実験の構成とより一致しています。 経口投与用に選択した GBE の濃度は 0.0667% (200 mg/kg/日) で、これはマウスで肝毒性反応を引き起こさない最高濃度でした。 この研究では、安全範囲内の最高用量の GBE のみを使用して、近視に対する抑制効果があるかどうかを調査しました。 マウスはレンズと食事に基づいて 3 つのグループに分けられ、0 ジオプター (D) レンズを使用した通常の食事グループ (コントロール 0 D グループ)、-30 D レンズを使用した通常の食事グループ (コントロール - 30 D グループ)、および 0.0667% GBEと-30 Dレンズグループ（GBE - 30 Dグループ）をそれぞれ混合した飼料（各グループのn = 8）。 通常の食事を与えられた 2 つのグループでは、-30 D レンズで治療した眼は 0 D で治療した眼よりも有意に高い屈折シフトを示しました (-9.92 ± 1.53 D 対 + 11.14 ± 6.60 D、p < 0.001) (図2A）。 -30Dレンズを備えた通常の飼料グループと比較した場合、GBE混合飼料を与えられたマウスは、-30Dレンズを備えた場合に著しく少ない屈折変化を示しました（-9.92±1.53D対-1.67±3.51D、p<0.001）（図） .2A）。 眼軸長の変化は次のとおりで、-30 D レンズで治療した眼は、通常の食事群の 0 D レンズで治療した眼と比較して、有意な眼軸伸長を示しました (0.22 ± 0.02 mm 対 0.19 ± 0.01 mm、p < 0.01)。 (図2B)。 - 30 D レンズを装着した眼では、GBEs - 30 D グループは、対照 - 30 D グループと比較して有意に小さい軸伸長を示しました（0.19 ± 0.02 mm 対 0.22 ± 0.02 mm、p < 0.05）（図 2B） 。 これらの結果は、マウス LIM モデルにおいて、GBE の経口投与により屈折変化と軸伸長が減少したことを示唆しています。 さらに、3つのグループのマウスにおける角膜の厚さと前房の深さの合計の変化と水晶体の厚さの変化も測定しましたが、有意な変化は観察されませんでした（補足図1）。 複数の研究により、近視では眼軸長が脈絡膜の厚さに特に関連していることが示されています41,42,43,44。したがって、近視によって引き起こされる眼軸長の伸長は、関連する脈絡膜反応ももたらすと考えられます。

GBE は、マウス LIM モデルにおける近視の屈折シフトと軸伸長を大幅に抑制しました。 (A)。 対照の０Ｄおよび－３０Ｄグループでは、－３０Ｄレンズで治療した眼は、０Ｄレンズで治療した眼よりも有意に大きな屈折シフトを示した（ｐ＜０．００１）。 対照 - 30 D グループと比較した場合、GBEs - 30 D グループのマウスは有意に減少した屈折シフトを示しました (p < 0.001) (n = 8)。 (B)。 対照０Ｄ群と比較して、対照−３０Ｄ群は有意な軸方向伸びを示した（ｐ＜０．０１）。 対照 - 30 D グループと比較して、GBEs - 30 D グループは有意に小さい軸方向伸びを示しました (p < 0.05) (n = 8)。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、バーは平均 + / - 標準偏差を表します。 一元配置分散分析を使用して有意差を決定しました。

近視進行の抑制メカニズムを実証するために、マウスをランダムに4つのグループに分けました：通常の食事による0Dレンズ群（対照0D）、GBEsによる食事による0Dレンズの群（GBEs 0D）、通常の食事によって誘発された両眼近視群（対照− 30D）、GBEs 食餌グループ（GBEs − 30D）で誘発された両眼近視（各グループの n = 10）。 脈絡膜血液灌流は、脈絡膜血管系の正面および B スキャン画像を提供できる光干渉断層撮影血管造影 (OCTA) によって測定されました。 全体的な正面画像 (図 3A-1) で、9 mm (幅) \(\times\) 9 mm (長さ) のサイズの正方形のフレームが OCTA 撮影用に選択され、中央に位置する部分的な正面画像が得られます。視神経上 (図 3A-2)。 顔面血管造影において視神経中枢を通過する水平線に相当するBスキャン画像を統一基準として解析した。 相対的な B スキャン画像では、脈絡膜は黄色のコイル内の白く強調表示された信号領域によって表されます (図 3A-3)。 血管造影を追加すると、赤い点は血液灌流のない信号を表し、赤い点を超えた領域は血液灌流が通過する領域を表します (図 3A-4)。 脈絡膜領域上の赤色ピクセルの割合を ImageJ によって測定し、総脈絡膜領域上の非赤色ピクセルのパーセンテージをスコア化することによって脈絡膜血液灌流を計算しました。 脈絡膜血液灌流の変化のヒストグラムでは、対照 0D グループと比較して、GBEs 0D グループのマウスは血液灌流の有意に大きな変化を示しました (8.48 ± 15.75% 面積 vs. 21.74 ± 10.54% 面積、p < 0.05)。一方、３週間の給餌後、対照−３０Ｄ群のマウスは脈絡膜血液灌流の減少を示した（８．４８±１５．７５％面積対−９．８２±９．４７％面積、ｐ＜０．０１）。 近視誘発の場合、脈絡膜血液灌流は、対照 - 30D グループと比較して、GBE - 30D グループで改善されました (2.29 ± 11.84% 面積 vs. 9.82 ± 9.47% 面積、p < 0.05) (図 3B) 。

GBE はマウスモデルにおいて脈絡膜血液灌流を増加させました。 (A)。 脈絡膜血液灌流は、脈絡膜正面血管造影および対応する B スキャンを可能にする OCTA によって測定されました。 (A-1)。 正面血管造影画像。 (A-2)。 視神経を中心とした縦横9mmの血管造影。 (A-3)。 En face の血管造影は B スキャン画像に対応します。 脈絡膜領域は、B スキャン画像上で黄色の丸で囲まれています。 (A-4)。 OCTA は脈絡膜層の B スキャン血管造影図を生成しました。 脈絡膜領域内の赤い点の割合は、ImageJ の面積測定ツールを使用して計算されました。赤い点を超えた領域 (100% 面積) が脈絡膜血液灌流領域です。 (B)。 3週間のGBE給餌後の脈絡膜血液灌流の変化は、近視誘発が行われたかどうかに関係なく、通常給餌グループよりも有意に高かった（p < 0.05）（n = 10）。 *p < 0.05、**p < 0.01、バーは平均 + / - 標準偏差を表します。 一元配置分散分析を使用して有意差を決定しました。

近視の進行を抑制するGBEのメカニズムをさらに検証するために、リアルタイムPCRのために対照0DグループおよびGBE 0Dグループのマウスから脈絡膜および網膜サンプルを収集しました（各グループn = 8）。 その結果、通常の食事を3週間与えた対照群と比較して、GBEを3週間与えた後の脈絡膜におけるEgr-1 mRNA発現が有意に増加したことが示されました(7.11±4.5倍対2.34±2.52倍、p<0.05)。 網膜では、3週間のGBE給餌後にEgr-1 mRNA発現が対照群と比較して有意に上方制御された(1.69±0.73倍対1.11±0.53倍、p<0.05)(図4A)。 さらに、eNOS mRNA発現は、対照群と比較して、3週間のGBE給餌後の脈絡膜において有意に上方制御された(2.56±0.97倍対0.72±0.55倍、p<0.01)(図4B)。

Egr-1 および eNOS の mRNA 発現は、GBE 投与により脈絡膜において有意に上方制御されました。 (A) Egr-1 mRNA 発現は、通常の固形飼料を与えられた対照群と比較して、3 週間の GBE 経口投与後の脈絡膜および網膜サンプルで有意な増加を示しました (p < 0.05) (n = 8)。 (B) eNOS mRNA 発現も、対照群と比較して 3 週間の GBE 摂取後の脈絡膜の有意な増加を示しました (p < 0.01) (n = 8)。 *p < 0.05、**p < 0.01、バーは平均 + / - 標準偏差を表します。 Ch：脈絡膜。 R：網膜。 GBE: イチョウ葉エキス。

上記の実験により、近視の誘発を伴うかどうかに関係なく、GBE の投与により脈絡膜内の血液灌流量が増加することが確認されました。 続いて、GBEs投与による脈絡膜血液灌流の変化が脈絡膜の厚さに及ぼす影響を調べるために、0Dレンズを装着したマウスに通常の餌と0.0667%のGBEsの餌をそれぞれ与え、3週間の給餌後に脈絡膜の厚さを測定したところ、脈絡膜の厚さは、0.0667% GBEs 飼料グループで大幅に厚くなりました（補足図 2）。 その後、生後 3 週齢のマウスに近視を誘発し、生後 6 週齢まで通常の飼料または 0.0667% GBEs 混合飼料を与え、給餌前後の脈絡膜厚の変化を群間で比較しました (各群 n = 6)。 。 対照−３０Ｄグループでは、対照０Ｄグループと比較して脈絡膜厚の有意な減少が実証された（−１．５５±０．４７μｍ対＋２．１０±０．８０μｍ、ｐ＜０．００１）（図５）。 対照の-30Dグループと比較した場合、GBEs-30Dグループのマウスは脈絡膜厚さの変化が有意に小さかった（-1.55±0.47μm対-0.28±0.81μm、p<0.01）（図5）。 これらの発見は、マウス LIM モデルにおける脈絡膜血液灌流の変化が脈絡膜厚さの変化と正の相関があるという既存の証拠をさらに裏付けます。

GBEsの投与により、脈絡膜の菲薄化が軽減されました。 通常の食事を与えられた 2 つのグループは、-30 D レンズ グループと 0 D レンズ グループの間で脈絡膜の厚さに有意な差を示しました (p < 0.001)。 -30Dレンズを装着したGBE食を与えられたマウスは、-30Dレンズを装着した通常食グループと比較して、統計的に有意な脈絡膜厚の増加を示した(p<0.01)(n=6)。 **p < 0.01、***p < 0.001、棒は平均 + / - 標準偏差を表します。 統計分析には一元配置分散分析を使用しました。 対照０Ｄ：両目に０Ｄレンズを備えた通常の餌を与えられたマウス。 対照−３０Ｄ：両目に−３０Ｄのレンズを備えた通常の餌を与えられたマウス。 GBE - 30 D: 両眼に - 30 D レンズを備えた GBE を与えられたマウス。

この研究では、ルシフェラーゼアッセイを使用して、EGR-1 に対するインビトロでの GBE の活性化が測定され、EGR-1 に対する GBE の用量依存的な活性化が確認されました。 この実験に続いて、近視進行に対するGBE経口投与の抑制効果がマウスLIMモデルを用いて調査され、GBE経口投与が屈折および眼軸長の変化を抑制する可能性があることが判明した。 続いて、近視誘発ありとなしの条件下で、GBEを経口投与したマウスと投与しなかったマウスの脈絡膜血液灌流の変化を比較したところ、GBE経口投与により、近視誘発の有無にかかわらずマウスの脈絡膜血液灌流が有意に増加することが判明した。 さらに、リアルタイム PCR を使用して、経口 GBE 後の Egr-1 および eNOS mRNA の有意な上方制御も確認されました。 マウス LIM モデルでは、GBE を経口投与すると、脈絡膜厚の減少が軽減されました。

GBE の有効成分の主なカテゴリーは、ギンコリド、ビロバリド (テルペンとしても知られる)、およびフラボノイドです 45,46。 フラボノイドには、内皮由来の弛緩因子とプロスタサイクリンの放出を促進することで動脈を拡張する能力があります47。 初期の研究では、GBE が血流に与える影響が注目されています。 GBE の経口投与は、脳虚血と心筋虚血を大幅に軽減し、その後の虚血損傷を軽減することが動物モデルで証明されています 48,49,50。 眼疾患への応用では、GBE の経口投与後、眼動脈の拡張終期速度と眼血流が増加しました。これは、一部の虚血性眼疾患に対して大きな治療の可能性を秘めており、現在、虚血性眼疾患の潜在的な治療選択肢として使用されています。正常眼圧緑内障35,51,52。 私たちの研究では、GBEの経口投与の有無による脈絡膜血液灌流の変化を評価するために、マウスモデルにOCTAが初めて使用されました。 私たちの研究に先立って、モルモット近視モデルの脈絡膜血液灌流を測定するために OCTA を使用する研究が行われていました 38,39,53。 これらの研究は、マウス モデルにおける OCTA の適用に対する強力な技術的サポートを提供します。 OCTA は数秒で画像ノイズを低減し、詳細を向上させ、脈絡膜血液灌流測定の視認性と精度を向上させることができます54。 私たちの実験は、近視誘発の有無にかかわらず、GBEを3週間摂取した後に脈絡膜血液灌流の増加が検出されることを直観的に実証しました。 そして、脈絡膜血液灌流の改善と近視進行の抑制におけるGBEの特性を組み合わせたもので、これは近視と脈絡膜血液灌流との関連性の証拠を提供するものである。

GBEs投与による近視の進行を抑制する可能性のあるメカニズムを検証するために、GBEsの3週間の経口投与後の網膜および脈絡膜におけるEgr-1およびeNOSの発現をリアルタイムPCRを使用して検出しました。 eNOS 発現を観察する理論的根拠は、以前の研究で eNOS が血管緊張と血管新生を調節し、その発現がより高い血流にさらされる動脈で上昇することが明らかになったということです 55,56。 インビトロ実験の結果と一致して、GBE の経口投与後、Egr-1 発現は脈絡膜と網膜の両方で有意に上方制御されました。 eNOS の発現に関しては、脈絡膜は eNOS 発現のかなりの上方制御を示しましたが、網膜は統計的に有意な増加ではない傾向を示しました。 これらの結果は、OCTA によって評価された脈絡膜血液灌流の増加に対応します。 したがって、GBE が近視の進行を抑制する 2 つの異なるメカニズムがある可能性があると考えられます。 まず、脈絡膜と網膜における Egr-1 の発現を上方制御することにより、軸方向の眼の成長を抑制します。 さらに、我々の実験結果から推測すると、GBEの投与は脈絡膜におけるeNOS発現の上方制御を誘導し、血管平滑筋細胞を弛緩させ、脈絡膜血管を拡張させ、脈絡膜血液灌流を増加させ、脈絡膜の厚さと脈絡膜の位置を維持することができる。網膜に作用し、近視の進行を抑制します。 さらに、いくつかの研究では、GBE による治療によりラット内側前頭前皮質におけるドーパミン放出が増加することも示されています 57,58。 ドーパミンは網膜の主要な神経伝達物質として、その放出を促進し、近視の進行を抑制することができます59。 GBEが近視の進行を抑制する別のメカニズムは、GBEが網膜内でドーパミンの放出を誘導することである可能性があると推論されており、これはさらなる実験によって検証される必要がある。

ただし、この研究にはいくつかの制限があります。 近視の進行に対する抑制効果を検証するために、0.0667% の濃度の GBE のみが選択されました。 GBE の経口投与濃度の選択は、マウスでの GBE 薬理試験のいくつかの報告から要約されました。 100～400 mg/kg の経口投与量が報告されており、GBE の投与量が 200 mg/kg を超えると、げっ歯類に肝毒性を引き起こすことが判明しています 60、61、62、63、64。 この実験では、近視の進行に対するその抑制効果を検証するために、200 mg/kg に相当する固形飼料を含む 0.0667% GBE を作成しました。 使用された薬物濃度がかなり高かったため、近視の進行を抑制するためのGBE経口投与の最適濃度をよりよく理解するには、異なる濃度のいくつかのグループを設定するさらなる研究が必要です。

近視の有病率は世界中で急速かつ継続的に増加しており、小児の近視を制御する戦略の方法を探索し開発することが急務となっています。 これまでのところ、私たちの研究は、天然抽出物であるGBEがどのようにマウスの近視を効果的に制御するかを実証した最初の研究です。 臨床試験に基づく予備研究として、私たちの研究は、近視の進行を抑制するGBEs投与の研究の基礎を築き、その後の用量関連実験の可能性を提供しました。 人間にとって、GBE は一般に忍容性が高く無害ですが、いくつかの副作用を引き起こす可能性もあります。 GBE の最大推奨用量は成人の場合 240 mg/日であると報告されています 65 が、小児の推奨用量に関する決定的な研究はありません。 将来の前向き臨床研究では、安全な線量を決定する方法と、小児の近視抑制に対する GBE の影響を最大限に活用する方法が、広範な議論を必要とするテーマです。

慶応義塾大学動物実験委員会より全ての業務が認可されました（認可番号：16017）。 すべての方法と実験プロトコルは、実験動物を扱うための国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインと、眼科および視覚研究における動物の使用に関する ARVO 動物声明に準拠しました。 私たちの研究も ARRIVE ガイドラインに従い、ランダム割り当ての原則に準拠しました。

293AAV 細胞株は親 ​​293 細胞株に由来し、クローニングと複数回のテストを経て Cell Biolabs, Inc. によって開発されました (Cell Biolabs, Inc.、米国カリフォルニア州カタログ番号 AAV-100)。 同社から購入した HEK 293AAV 細胞株を Egr1 ルシフェラーゼ レポーター遺伝子構築物 (Cignal Lenti EGR1 レポーター (Luc)、Qiagen、フェンロー、オランダ) でトランスフェクトし、EGR-1 転写活性をモニターしました。 この方法は以前に報告された方法に従った22。 簡単に説明すると、Cignal Lenti Egr-1 レポーター Luc (QIAGEN、オランダ #CLS-5021L) ウイルスを使用して、SureENTRY Transduction 試薬 (QIAGEN、オランダ #336,921) を使用して 20 時間未満細胞を感染させました。 (25MOI)。 感染後、細胞を 1 回継代し、感染した細胞が完全に死滅しなくなるまで増殖させました。 5 つのコロニーをピックアップし、HTS Transwell®-96 レシーバー プレートに 2.0 × 104 細胞/ウェルで播種しました。 私たちの研究室が購入したEgr-1-ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物をトランスフェクトしたすべての細胞株の中で、HEK 293AAV EGR-1-Luc細胞株は、PMA（ポジティブコントロール）処理後に最も安定してEGR1活性を発現できました。この系統は、スクリーニングアッセイ用に最も反応性の高いコロニーとして選択されました。

ルシフェラーゼアッセイは以前に報告されたように実施されました22。 ２回継代したＨＥＫ ２９３ＡＡＶ ＥＧＲ－１細胞をＨＴＳ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）－９６レシーバープレート、白色、ＴＣ処理済み、滅菌（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク、米国＃３７８３）に移し、１０％ＦＢＳを含む７０μｌ培地をそれぞれに加えたウェル当たりの細胞数は 2.0 × 104 で、5% CO2 インキュベーター内で 37 °C で一晩インキュベートしました。 GBE (INDENA JAPAN CO.、東京、日本 #9,033,008) を秤量し、DMSO (和光、東京、日本 #043-07,216) に溶解して 100 mg/ml 溶液を形成し、撹拌後室温で一晩光から遠ざけました。 。 最終濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５０ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌとなるように上清を１：４００、２：４００、３：４００の比率でＤＭＳＯに溶解し、各ウェルに７０μｌずつ添加した。 細胞を 5% CO2 インキュベーター内で 37 °C で 18 時間インキュベートしました。

EGR-1 活性化剤として知られる 100 nM PMA (Promega、USA #V1171 または Abcam、England #16,561-29-8) のポジティブコントロールを使用しました66。 化学物質を含まないDMSO含有培地を陰性対照として使用した。 使用したGBEの濃度はそれぞれ0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、0.75 mg/mlでした。 まず第一に、以前の研究で、我々は 0.25 mg/ml のクロセチンが DMSO に可溶な最大濃度であり、ルシフェラーゼ アッセイにおいて有意な Egr-1 活性化を誘導することを発見しました 22。 この経験に基づいて、推奨濃度として 0.25 mg/ml の GBE を設定しました。 次に、マウスの場合、1 日量 200 mg/kg を超えて GBE を摂取すると、げっ歯類に肝毒性を引き起こす可能性があることがいくつかの研究で確認されています 62,63,64。 濃度変換後、200 mg/kg/日の給餌濃度に対応する in vivo 実験濃度は 0.50 mg/ml です。 したがって、第 2 濃度として 0.5 mg/ml GBE を設定しました。 最後に、インビトロの超高濃度条件下での EGR-1 活性の変化を調査するために、0.75 mg/ml GBE を 3 番目の濃度として設定しました。 ONE-GloTM ルシフェラーゼ アッセイ システム (Promega、米国ウィスコンシン州マディソン #E6110) を使用してルシフェラーゼ発現を定量しました。 ONE-Glo™ルシフェラーゼアッセイシステムの10mlのGlo™ルシフェラーゼアッセイバッファー1本とONE-Glo™ルシフェラーゼアッセイシステムの1バイアルのONE-Glo™ルシフェラーゼアッセイ基質を均一に混合した後、各ウェルに70μlを加えます。 Synergy HTX (Biotek、バーモント州、米国) で、次の条件下で蛍光強度を特定します: 30 秒間直線的に振盪、12 分間遅延、ゲイン 180、積分時間 0.5 秒、読み取り高さ 1.0 mm。

C57BL6/J マウス (CLEA、静岡、日本) を、23 ± 3 °C に維持された空調室内で、1 ケージあたり 4 匹または 5 匹の従来の透明なマウス ケージ (29 × 18 × 13 cm) に入れて 12 時間飼育しました。日周期であり、通常の食物（MF、オリエンタル酵母株式会社、東京、日本）および水道水を無制限に摂取できること。 GBEs を与えられたマウスの場合、10 g のマウスの平均摂食量は 1 日あたり約 3 g であるため 67,68、給餌は、我々が計算したケージあたりのおおよその週の摂食量に従って実行されました。 マウスの体重は毎週記録され、GBEの給餌が通常の食物摂取マウスと比較して体重増加に影響を及ぼさないことを確認しました。記録では、通常の給餌グループとGBEの給餌グループの間に体重に有意差がないことが示されました（補足図3）。 週に一度は餌、水道水、ケージを交換し、マウスの生活空間を清潔に保ちます。 麻酔については、各マウスの体重に応じて麻酔量を調整し、約 0.1 ml/10 g の麻酔が確実に投与されるようにしました。 誤差を最小限に抑えるために、すべての実験では同性（雄）および体重（10±1 g）のマウスを使用し、すべてのマウスをランダムに割り当てました。 実験の均一性を確保し、実験結果に対する客観的要因の影響を最小限に抑えるために、実験全体を通じて、すべてのマウスを均一な光と温度条件下に保ち、各実験の測定時間が一貫していることを保証し、平均値が維持されるようにしました。各マウスの測定時間は同じになるように試みました。

マウス LIM モデルは、以前に報告されたように調製されました 40。 マウスの頭の輪郭に合わせたマウス用メガネフレームを作成し、3Dプリンターで出力しました。 PMMA 製のマイナス 30 D レンズは、近視誘導用に作成されました。 -30 D レンズを使用した近視誘発は、形状剥奪近視モデルと比較して、より大きな近視シフトを示しました 40。 以前に使用した LIM モデルとはいくつかの違いがありますが、単眼誘発の代わりに両眼近視誘発を使用しました。 メガネの左右の目をマウスの頭蓋骨フレームの形状に合わせて調整し、ネジでスティックに固定し、自己硬化型歯科用接着剤システムを使用してスティックをマウスの頭蓋骨に接着しました。 これは、ミダゾラム（Sandoz KK、港、日本）、メデトミジン（Domitor®、Orion Corporation、トゥルク、フィンランド）、および酒石酸ブトルファノール（Meiji Seika ファルマ株式会社、東京、日本）を組み合わせた全身麻酔下で行われました。 (MMB)。 各マウスの投与量は0.01ml/gであった。

近視誘導段階では、マウスに通常の餌（MF、オリエンタル酵母株式会社、東京、日本）または候補化学物質 0.0667 パーセントの GBE を含む混合餌（INDENA JAPAN CO.、東京、日本 #9,033,008）を与えました。 0.0667% GBE には、ケルセチン、ケンフェロール、イソラムネチンのフラボノール配糖体が 24%、テルペントリラクトンが 6% 含まれています。 ＧＢＥ混合飼料の対応する濃度は２００ｍｇ／ｋｇ／日であり、これはインビトロ実験でのＥＧＲ－１の顕著に高い活性を引き起こすＧＢＥの濃度と一致する。 GBE の添加および 0.0667% GBE 混合飼料の製造はすべて、飼料製造会社 (オリエンタル酵母株式会社、東京、日本) によって製造されています。

近視誘発の開始段階（生後 3 週間）と終了段階（生後 6 週間）で、屈折、眼軸長、および脈絡膜の厚さを赤外線フォトリフレクター（バーデン ヴュルテンベルク州シュトゥットガルトのシュタインバイス トランスファー センター）を使用して測定しました。ドイツ）およびSD-OCTシステム（Envisu R4310、Leica、Microsystems、Wetzlar、ドイツ）。 すべての測定は、0.5% トロピカミドおよび 0.5% フェニレフリンを含む散瞳点眼薬 (参天製薬株式会社、大阪、日本) を使用して実行され、すべて MMB 全身麻酔下で実行されました。 屈折値は、連続的なデータ追跡により測定されました。 角膜頂点反射とともに、角膜前面から網膜色素上皮までの眼軸長を測定しました40。 脈絡膜の厚さは以前の報告に従って測定されました22,69。 簡単に説明すると、平均脈絡膜厚は、網膜色素上皮と脈絡膜後面の境界にある、円板から離れた脈絡膜領域によって計算され、輪状円板から0.5 mmの半径はImageJ定量分析によって得られました（National米国メリーランド州ベセスダ衛生研究所、ベセスダ）。 次いで、平均脈絡膜厚を、面積を円周で割ることによって決定した。

マウスの屈折、眼軸長、および脈絡膜厚に対する食事因子の影響を比較するために、生後 3 週目の C57BL6/J マウスを、コントロール 0 D グループ、コントロール - 30 D グループ、GBE - 30 D にランダムに分けました。 Dグループ。 対照０Ｄ群および対照−３０Ｄ群には通常の食事を与え、両目にそれぞれ０Ｄレンズおよび−３０Ｄレンズを装着した。 GBEs - 30 D グループには、両目に -30 D レンズを装着しながら、0.0667% GBEs 混合餌を与えました。 この期間に近視誘導も同時に行いました。 給餌と近視誘発の両方を生後 3 週目から 6 週目まで実施した。 単眼近視誘発の代わりに両眼近視誘発を使用したため、それぞれの目からのデータが独立して分析されました。 マウスの脈絡膜血液灌流に対する食事因子の影響を比較するために、生後 3 週間の C57BL6/J マウスをランダムに 4 つのグループに分け、2 つのグループには近視誘発のない通常の食餌と GBEs 食を与え、他の 2 つのグループには近視誘発を行わずに与えました。近視誘導が行われている間、被験者には通常の食餌とGBEs食が与えられました。 彼らは生後3週間から6週間まで給餌されました。

脈絡膜血液灌流は、SS-OCT / OCTA デバイス (XEPHILIO OCT-S1、キヤノン メディカル システムズ、東京、日本) を使用して初期段階 (3 週齢) と終期 (6 週齢) で測定されました。スウィープ光源技術を採用し、眼底深部まで光源が到達し、硝子体から網膜、脈絡膜、強膜境界まで広範囲を高精細に撮影できます。 OCTA は、同じ場所での繰り返しの OCT スキャンによって観察された赤血球の移動度からの強度と位相情報の変化を分析することにより、生体内での血流を決定します70,71。 視神経を中心とした 9 mm (幅) \(\times\) 9 mm (長さ) の正方形領域が正面血管造影を構築するために選択され、同時に網膜全体の脈絡膜レベルで 464 回の連続 OCTA B スキャンが行われました。異なる位置での血液灌流信号の変化を観察するために、各記録位置で強膜を取得しました。 各血管造影には一致する B スキャン画像があるため、私たちの研究では、視神経の中心領域にわたる正面血管造影に対応する B スキャン画像を統一基準として解析しました。 B スキャン画像では、脈絡膜血管を覆う赤い点がないことが観察され、赤い点で覆われていない領域を脈絡膜血液灌流として計算した結果は、既存の研究結果、つまり脈絡膜血液と一致しました。近視の誘発により灌流が減少しました38。 したがって、C57BL6/J マウスでは、RPE 層に豊富な色素粒子があるため、血液灌流シグナルが RPE の下で反転していると考えられました。 血液灌流のない領域は、フローボイド（FV）としても知られるレッドノイズポイントで覆われており、いくつかの研究では、脈絡膜血液灌流が絨毛毛細管のFVと負の相関があることが判明しました72、73。 この研究では、ImageJ のポリゴン選択ツールを使用して、B スキャン画像内の脈絡膜領域全体を円で囲み、赤色の割合を計算するために使用されるアルゴリズム閾値選択である全脈絡膜領域における FV の面積比を分析しました。ピクセル。 脈絡膜血液灌流は、総ピクセル数に対する非赤ピクセルの割合をスコア化することによって計算されました。

OCTAによって脈絡膜血液灌流を評価した後、マウスに過剰量のMMBを注射して深い麻酔を生じ、頸椎脱臼によって安楽死させた。 その後、眼球を摘出して脈絡膜組織と網膜組織を分離し、液体窒素中で直ちに凍結し、-80 °C で保存しました。

リアルタイム PCR では、組織を TRI 試薬 (MOR、マイアミ、フロリダ州、米国 #TR118) で溶解して、変性タンパク質を可溶化し、組織 RNA を分離しました。 1:2 および 1:4 の比率で EtOH に溶解した RWT (QIAGEN、ヒルデン、ドイツ、#1,067,933) および RPE (QIAGEN、ヒルデン、ドイツ、#1,018,013) を加えて、低分子 RNA を単離し、微量のRNA を除去します。塩。 遺伝子発現解析のために、RNA サンプルを RNase フリー水 (TAKARA HOLDINGS INC.、京都、日本、9012) に溶解し、分光光度計 (NanoDrop; ThermoFisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で測定しました。

抽出 RNA (200 ng) を、gDNA リムーバー付き 4xDN Master Mix (TOYOBO、大阪、日本、#FSQ-301) を使用して cDNA に変換し、5xRT Master MixII.SYBR グリーン RT-PCR を THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO、大阪、日本、#QPS-201）、PCR は StepOnePlus リアルタイム PCR システム（Applied Biosystems、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して実行されました。 2 − ΔΔCt 法を使用して差次的な遺伝子発現を定量化し、それを参照遺伝子 (GAPDH) に標準化しました。 qPCR のプライマー配列は次のとおりです:マウス Egr-1 フォワード: CCACAACAACAGGGAGACCT、マウス Egr-1 リバース: ACTGAGTGGCGAAGGCTTTA、マウス eNOS フォワード: TCCGGAAGGCGTTTGATCマウス eNOS リバース: GCCAAATGTGCTGGTCACCマウス GAPDH フォワード: AGGAGCGAGACCCCACTAACマウス GAPDH リバース: GATGACCCTTTTGGCTCC交流

すべての結果は平均±標準偏差 (SD) として表され、ブラインド手順を使用して分析されます。 独立した t 検定または一元配置分散分析を使用して差の統計的有意性を評価し (Microsoft Excel 2003、米国)、p 値 < 0.05 の結果が有意であると見なされました。 検出力分析は Cancer Research Network (SWOG) で実行され、p 値 < 0.05 の結果に使用され、計算された検出力はすべて 0.8 を超えています。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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著者らは、批判的な議論をしていただいた副島由良氏、西巻和也氏、青柳博司氏、志土見正氏（ロート製薬株式会社、東京）に感謝の意を表します。 技術的なご指導と運営上のご支援を賜りました、石田 明、黒羽 晋、芹沢 直也、庄田 千夏（慶応義塾大学大学院医学系研究科）に感謝いたします。 国際特許WO2018/212152に基づき、国際的に特許出願されています。

今回の研究はロート製薬株式会社からの資金援助を受けました。

Jing Hou 氏と Kiwako Moe 氏も同様に貢献しました。

〒160-8582 東京都新宿区信濃町35 慶応義塾大学医学部眼科

Jing Hou, Kiwako Mori, Shin-ichi Ikeda, Heonuk Jeong, Hidemasa Torii, Kazuno Negishi, Toshihide Kurihara & Kazuo Tsubota

〒160-8582 東京都新宿区信濃町35 慶応義塾大学医学部光生物学研究室

Jing Hou, Kiwako Mori, Shin-ichi Ikeda, Heonuk Jeong, Hidemasa Torii & Toshihide Kurihara

Tsubota Laboratory, Inc., 304 Toshin Shinanomachi-ekimae Bldg., 34 Shinanomachi Shinjuku-ku, Tokyo, 160-0016, Japan

Kazuo Tsubota

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JH は実験を実施し、データを分析し、図を作成し、原稿を作成しました。 KM、TK、KT はこの研究を発案し、その設計と調整に参加し、原稿の草稿を手伝ってくれました。 著者全員が原稿の改訂に貢献しました。 原稿の最終版はすべての著者によって承認されており、著者はその内容について責任を負うことにも同意しています。

Correspondence to Toshihide Kurihara or Kazuo Tsubota.

提出された作品以外では、坪田一男氏は、近視治療用の製品を開発している会社、株式会社坪田研究所（東京）のCEOであると報告しています。 他の著者は利益相反を宣言していません。

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転載と許可

Hou, J.、Mori, K.、Ida, Si. 他。 イチョウ葉エキスは脈絡膜循環を改善し、マウスの近視を抑制します。 Sci Rep 13、3772 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30908-1

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受信日: 2022 年 8 月 18 日

受理日: 2023 年 3 月 3 日

公開日: 2023 年 3 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30908-1

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